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(無題) 削除/引用 No.10808-8 - 2022/09/26 (月) 10:50:09 - 774R 一応、念のため書いておきます。 2-300から徐々に減弱するとのことですが、減弱する前のシグナル強度が非常に強い場合はテンプレート過剰の可能性大ですが、全体にシグナルが弱くて2-300を超えると判別できなくなってるだけの可能性もあるので切り分けて考えてください。 あと、特定の配列だけが読めないことも稀にあります。たとえば繰り返し配列で鋳型が立体構造を作ってしまう場合や、合成された鎖の方が立体構造を作り、それ以降が判読できないなんてこともあります。

(無題) 削除/引用 No.10808-7 - 2022/09/26 (月) 10:39:36 - G25 >鋳型過剰の典型的な症状です。プラスミドを定量して適切な量を投入していますか？　 ストライクゾーンを外れるにしても高めのほうが問題が起こりやすいです。 近頃じゃ検出感度がよくなっていて、低めでもちゃんと読めることが多いです。キャピラリー電気泳動なのでもともと調製したサンプルのごく一部しか解析にかけないものですし。シグナル弱すぎたら多めにかけてやり直せば大抵は大丈夫（外注でも追加料金なしでやってくれてる）。

(無題) 削除/引用 No.10808-4 - 2022/09/26 (月) 10:31:11 - G25 >しかしピークが2-300 bpあたりから徐々に減弱したり、長く読めないことが続いています。 鋳型過剰の典型的な症状です。プラスミドを定量して適切な量を投入していますか？　 吸光度などで見るより、電気泳動してマーカーとの比色でestimateしたほうが間違いがないです（たとえ目測であっても）。定性的な品質もチェックできますしね。 PEG沈はKlenow（とRI)を使った古典的なサンガーシークエンスではシークエンスの品質を改善しますが、現在主流の耐熱性ポリメラーゼを利用したサイクルシークエンスでは目立った効果はありません（ABIはそうは言わないけど）。 PEG沈はRNaseで分解されたRNAの断片を除去することでシークエンスの品質を改善します（EtOH/PrOH pptでは除去できない）。Klenowを使ったシークエンス反応では、鋳型にRNA断片が混じっているとそれがランダムプライマーとなって、すべてのラダーですべての塩基がポジティブになるという症状になります。だからPEG沈は有効でした。 しかし、サイクルシークエンスではそういうこと起きないんですよね。 一時期、プラスミド精製装置（ロボット）を使っていましたが、それはPEG pptどころかRNase処理もしないので、出来上がりのプラスミドにはRNAがごっちゃり入っていました（RNAを除きたいときはで出来上がりのプラスミド溶液にRNase処理を加えるなどする）。しかし、それをそのままサイクルシークエンスに使ってもなんの問題もありませんでした。 精製装置のメーカーの人に、さすがにそれじゃそのままシークエンスはできないでしょと聞いたら、シークエンスシステムを供給しているメーカーがプラスミドの精製度が重要で超遠心やらPEG pptを推奨しているのであんまり大きい声じゃ言えないけど、全然問題ないです、と。

(無題) 削除/引用 No.10808-3 - 2022/09/24 (土) 23:57:35 - SYBR master 現在、手持ちでシークエンサー無いので外注してますが、自分は8-900は読めてます。 Sangerの場合で、シークエンスが長く読めない理由の一つとして、鋳型量が多いことがトラブルシュート例であります。 DNA量、計っています？

(無題) 削除/引用 No.10808-2 - 2022/09/24 (土) 23:31:37 - 774R ミニプレップをしたプラスミドを外注に出して毎回800〜900bpくらいまでエラーなしで読めてます。 PEG沈は全くやってない。 solIにRNaseを加える方法だと、エタ沈後のRNAの混入が劇的に少なくなります。沈殿物の量を見れば一目でわかるくらいです。 フェノクロもやってない。 ただ、solIIIの後、クロロホルムを数滴加えて遠心してデブリが混じらないようにはしている。意外と、solIIIの後のデブリってSDSを含んでるからか、以降の酵素反応にも悪影響がある気がしてます。

サンガーシークエンスではPEG沈殿は必要か 削除/引用 No.10808-1 - 2022/09/24 (土) 21:16:07 - 細胞 お世話になります。 大腸菌を1mlからミニプレップし、TEで溶解したエタちん物を適切な濃度のプライマーと一緒に学内のシークエンスコアに送りシークエンスをしてもらっています。pcDNA3.1＋です。 しかしピークが2-300 bpあたりから徐々に減弱したり、長く読めないことが続いています。 皆様はPEG沈殿はしておりますでしょうか？ PEG沈殿ではプライマーを除いたりRNAを除けると思うのですが、私の問題はPEG沈殿をしたところで変わらずでしょうか？

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