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(無題) 削除/引用 No.10798-5 - 2022/09/22 (木) 12:37:27 - 774R 会社は違うものの、GeneWizのFragmentGENEを使ったことがありますがコスパは良いと思います。 ただ、クローニングしてないだけあって、配列の一部欠損やエラーがいくつか見られたので、鋳型があるならPCRをした方が当たりの確立が高いと思います。 ストップ後のHisタグ配列は無視で大丈夫。

(無題) 削除/引用 No.10798-4 - 2022/09/22 (木) 12:20:54 - サクラ idtからgblockというのも出ています。 これだと、両端を制限酵素で切ったら、PCRもせずに、クローニング完了ですよね。 増幅して、切って、入れてとかやっているより、確実でしょうか？ コストもそこまで変わらない気が。。。 もう一点質問ですが、購入したベクターのC末に余計なHisタグがあるのですが、制限酵素的になかなか除けません。終止コドン以降にあるので、無視でもいいのでしょうか？ 他にいいベクターがありませんでした。

(無題) 削除/引用 No.10798-3 - 2022/09/22 (木) 11:51:13 - おお 基本できるはずです。メガプライマーといって数百ベースのPCRプロダクトをプライマーにすることもありますので。もし、うまく増えないなら、その８０bプライマーの５’から２０ベースぐらいの配列のプライマーで再PCRするか、微量の８０bプライマーと通常の量の５’から２０bのプライマーを混ぜてPCRする手もあります。

(無題) 削除/引用 No.10798-2 - 2022/09/22 (木) 11:32:49 - 774R 20塩基のアニールする領域と60塩基の追加配列ってことですね？ 問題ないと思います。

クローニングの方法論 削除/引用 No.10798-1 - 2022/09/22 (木) 11:17:44 - サクラ あるタンパク質をHisタグ、TEV proteaseの配列付きでプラスミドに入れたいのですが、20bpのOFRのATGを含む配列と80bpほどのHisタグ+TEV proteaseからなるlong primerで増幅して、クローニングして成功しますか？ TEV直後からORFが開始しているため、制限酵素サイトが無い状態です。こういう場合、多少お金を払っても、人工遺伝子を作製するのがよいでしょうか。

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