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(無題) 削除/引用 No.10797-16 - 2022/09/24 (土) 18:33:08 - MMM ＞あのさん ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.10797-15 - 2022/09/24 (土) 10:28:24 - あの 二次抗体後は、 　　リンス、リンス、洗い5分(か10分)を3から5回 を基準に考えています。 洗浄効率の他に、細胞の剥がれ具合も考慮して。 なお 当方ではさまざまな初代培養もしているのと、 共焦点顕微鏡を使っているので、 他の方とはもしかしたら微妙に違うかもしれませんが、 参考になれば幸いです。

(無題) 削除/引用 No.10797-14 - 2022/09/24 (土) 08:42:08 - MMM 私は、洗浄は入念に行うと教わったのですが、時間が長すぎるのもマイナスになるのかなあと思っているところです。

(無題) 削除/引用 No.10797-13 - 2022/09/24 (土) 08:39:57 - MMM ＞あのさん 洗浄は回数は何回もやってます。 私も一次抗体オーバーナイトはありますが、二次抗体オーバーナイトはありません。 あのさんの、「洗い、リンス、リンス、5分を3回」は、2次抗体後もこのくらいでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.10797-12 - 2022/09/23 (金) 13:13:57 - あの 洗いは、一回ごとの長さよりも、回数の方が大事だと思います。 特に、先に書いている、リンスリンスで、いかに残存物を減らすかが大事です。 このあたりを直感的に理解しやすいように、初心者には、 　手のひらの上に、ママレモンなどをたらして、 　蛇口から出る水を使って 　どうやったら早く効率的に手のひらから洗剤を除去できるか 体感してもらったりします。

(無題) 削除/引用 No.10797-11 - 2022/09/23 (金) 12:53:52 - あの 洗浄や第二抗体反応などをオーバーナイトにすることはしないです。 第一抗体反応ならありますが。

(無題) 削除/引用 No.10797-10 - 2022/09/23 (金) 10:56:14 - MMM >あのさん 私は最初に教わったときは、洗浄は長めに何回も行ったほうが良いと教わったので、入念にやってました。 時には、2次抗体後の洗浄は、PBSTを入れて、オーバーナイトの時もあります。 洗浄のやりすぎも良くないのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.10797-9 - 2022/09/22 (木) 20:24:07 - あの 気づいて来ているようですが、 細胞なら固定時間は、数十秒から1分で大丈夫です。 長すぎると抗原性がなくなります。 洗いも、リンス、リンス、5分を3回で十分なことが多いです。

(無題) 削除/引用 No.10797-8 - 2022/09/22 (木) 18:53:41 - MMM >TSさん 返信いただきましてありがとうございます。 確かに1次抗体がダメになってる可能性もあります。 また、いろいろ考えなおすと、以前行ったときは、パラホルムアルデヒド固定を10分で行ってましたが、最近行ったときには、他の作業をしていて長くなってしまい、30分か40分ぐらい行ってました。 もしかしたら、固定が長くなり過ぎた影響もあるかとは思います。

(無題) 削除/引用 No.10797-7 - 2022/09/21 (水) 22:36:11 - TS > シグマのCyp2c55 シグマのCy3

(無題) 削除/引用 No.10797-6 - 2022/09/21 (水) 22:07:11 - TS 今の情報だと、なぜ2次抗体のせいにするのかなと思うのですが、 どっちかがへたっているのでは？ むしろ2種類の2次を試してダメなら、1次が悪いと思うのがリーズナブルでは？ シグマのCyp2c55 も使ってましたが、悪くなかったです。

(無題) 削除/引用 No.10797-5 - 2022/09/21 (水) 21:17:24 - MMM ＞TSさん Thermo fisherとシグマアルドリッチでした。 シグマのほうはalexa fluorではなくcy3でした。 以前は、使用している一次抗体で免疫染色はできてましたが、たいぶやっていなくて、最近になってやったらうまくいかないので二次抗体のせいかと思っているところです。 でも、もしかしたら別な原因があるかもしれません。 ＞あのさん 洗いはどのようにやってますでしょうか？ 私は、PBSTで、5〜10分おきに洗浄を１時間以上をかけて、何回も洗浄してます。 また、二次抗体のグレードで染まり方がかなり変わりますでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.10797-4 - 2022/09/21 (水) 21:01:54 - あの 補足します。 第二抗体の選択では、吸着処理が何に対してされているかに注意したら良いです。 色々されているグレードの方が、少し高くなりますが、安心を買うようなものです。

(無題) 削除/引用 No.10797-3 - 2022/09/21 (水) 20:55:50 - あの 染色で、二次抗体が問題になることはほとんど無いです。 それよりも、第一抗体が悪いか、サンプル中の抗原性が低下したか、 バックグラウンドが高くてＳＮ比が悪いかだと思います。 最後については、たとえば初心者で多いのは、 洗いが悪くて、バックグラウンドが高くなるということです。

(無題) 削除/引用 No.10797-2 - 2022/09/21 (水) 15:08:57 - TS ちなみに今はどちらのを使ってるんでしょうか。開示しても問題のであれば。 うちはAbcamかThermo fisherを使いますけど、特にどっちでも大差感じません。 変なところじゃなければ、2次抗体はたいがい大丈夫で、1次抗体の問題なんじゃないかと想像するのですけど、1次抗体が細胞染色で問題ないという検証があるんでしたか（たとえばHRPでの系とか）。

細胞免疫染色の2次抗体（Alexa Fluor) 削除/引用 No.10797-1 - 2022/09/21 (水) 14:04:13 - MMM 細胞免疫染色を行い、蛍光顕微鏡でタンパク質を観察しています。 目的のタンパクは、細胞内に少ないわけではないのですが、蛍光が弱く感じます。 Alexa Fluorの2次抗体（緑と赤の両方)で、しっかりと観察できる抗体がありましたら教えていただけますでしょうか（できれば値段も手ごろなもの希望)。 Alexa Fluorでなくても構いません。 よろしくお願いいたします。

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