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(無題) 削除/引用 No.10782-6 - 2022/09/16 (金) 12:03:05 - おお >[Re:4] さいさんは書きました : > エタノールに関しては購入したもの(70%で売っているもの)を使っているので濃度はあっているはずです。 > > となると、細胞数を間違っているか遠心で落ちていないか吸っているかですかね。 > 遠心は一応11,000g3分行って、少ないですがペレットは見えてます。 修了に関係あるかわからんけどちょっと強すぎないか。

(無題) 削除/引用 No.10782-5 - 2022/09/16 (金) 11:52:00 - zam 見込みの1/10量ぐらいですね。 操作ミス、機器の故障、試薬の入れ忘れ、試薬やサンプルの取り違え。 細胞数が違っていた、間違って細胞を捨てた、DNaseやバッファーにRNaseがコンタミしていた、還元剤が酸化していた。エタノールの濃度が違っていた。 分光光度計かNanodropが壊れていた、UVのバックグラウンドを取るときに、間違ったものでバックグラウンドを取ってしまった。 そもそも細胞のRNA量が少ないとか、キットが不良品だったとか。 上げれば切りがないですね。

(無題) 削除/引用 No.10782-4 - 2022/09/16 (金) 10:05:25 - さい エタノールに関しては購入したもの(70%で売っているもの)を使っているので濃度はあっているはずです。 となると、細胞数を間違っているか遠心で落ちていないか吸っているかですかね。 遠心は一応11,000g3分行って、少ないですがペレットは見えてます。

(無題) 削除/引用 No.10782-3 - 2022/09/16 (金) 09:41:36 - Karas 分解には早すぎるかもしれません。。 複数の線維芽細胞からそのキットで精製したことがありますが、 うまくいかなかった際の原因は、 �@実は遠心のgが不十分であり遠心後に回収した細胞数が予想より少なかった �A細胞ペレット作製時に上清と一緒に細胞を誤って捨ててしまった �B70％エタノールの調整間違い（エタノール濃度低かった） でした。あとは最初の溶解ステップで組織や細胞塊をちゃんとバラバラにし、透明になったのを確認せずに進めてしまった時は、かなり低い濃度だった覚えがあります。 何にせよ、細胞数を揃えてちゃんと溶解するところまで出来れば、あとはエタノール濃度を間違えない限りうまくいきますよ。

(無題) 削除/引用 No.10782-2 - 2022/09/16 (金) 09:14:18 - おお 少ないですね。収量で１ug（総重量で）あっても良さそうだけどね。 分解してるのかもしれないけど、、、カラムから完全に溶出できてないとかそういうこともあるかもしれないし、答えようがありませんねぇ。。。 Lysisしてカラムにのせるまでは余程のことがない限り分解する余地が殆ど無いし、カラムについていれば途中で分解するようなことがあってもそんなになくなってしまうと思えないし、溶出してから分解したとしても分解したRNAが残っているわけだからUVで測定するには数字にあまり反映されないだろうし。 なんだろうね。少なかったと言われただけで原因を当てるのは運ゲーみたいなものかもしれない。

繊維芽細胞からのRNA抽出 削除/引用 No.10782-1 - 2022/09/16 (金) 08:37:56 - さい 繊維芽細胞からのRNA抽出を試みたのですが 2×10^5ぐらいの細胞を使って1.5ng/マイクロリットル(総液量が60マイクロリットル)程度しか撮れませんでした 分解されてしまったのでしょうか？ キットはnucleospin RNAを使いました。 用いた細胞が少ないので収量が低いのは覚悟していたのですが低すぎる気はします

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