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(無題) 削除/引用 No.10780-23 - 2022/09/20 (火) 00:35:12 - おお >DNAのコイル状態とグロビュール状態の変化は相転移現象なので、転移点を境に急に性質が変わります。 電荷による相互作用を外すことを言っているのだから、染色体構造に特化した話にすり替えているだけのはなし。相転移があるとしても他のコンプレックスも一様に１Mというわけでもない。 また、１M NaClというけれども、金属イオンの量や細胞（核）の量とバッファーの割合によっては３００mMあたりからねんちょうな溶液になりおっしゃっている言葉でいえば ”相転移” が起こり得ることも事実。１M NaClというからにはその前提の条件の提示も必要７日もしれない。

(無題) 削除/引用 No.10780-22 - 2022/09/19 (月) 21:36:46 - G25 > bふさんも書かれていますが、DNAのコイル状態とグロビュール状態の変化は相転移現象なので、転移点を境に急に性質が変わります。 bふさんはそのような主張をしているだろうか？ 自分の論文の主張を強化するために引用文献を上げてるけど、実は引用先ではそんなこと言っていないってタチ悪いことしてるのをしばしば目にするが、それに近い。 あとむずかし用語とか概念を持ち出してケムにまこうとする嫌な感じもする。素人相手には効き目があるかもしれないけど、プロには見透かされるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.10780-20 - 2022/09/19 (月) 21:27:02 - G25 そりゃ、高塩濃度/高張性の溶液に曝せばシュリンクが起こるのは当然だけど、それが抽出原理の本質だ！と飛び着くのはおかしいでしょう？　実は他の効果が重要なのだけれど、副反応としてシュリンクが怒ってるかもしれないじゃない。 あなたの主張していることが当たっているかもしれない。だけどあなたの論拠では、他の可能性を排除するものでも無い。なのにあなたは自分の飛びついた考えに固執して頑なに他の主張を否定しにかかる。そこが問題です。 因果関係の正しい理解とか論拠から主張を導く論理性(何が言えて何が言えないか)とか、その辺に弱さを感じずにはいられません。これ、論文を書く商売にとってはクリティカル。 思い込みが強すぎて、近視眼的、井の中の蛙、我田引水、牽強付会、になってませか、

(無題) 削除/引用 No.10780-19 - 2022/09/19 (月) 08:08:05 - おお そもそも、核膜は水、金属イオンなどの小さな分子は自由に出入りできるので塩濃度差で浸透圧の差を生じません。仮に生じたとして内容物が出るためには膜が浸透圧のさで壊れないと行けないだろうから、核膜かシュリンクしているというのは理屈に合わない。経験上塩濃度を上げて核たんぱくを抽出しても不溶な成分（クロマチンや各マトリクス）の体積はそんなに変わらず、むしろ増えているようにも感じる。 シュリンクしているものは単に核の内容物がなくなったあとの染色体などを見ているのではないだろうか。

(無題) 削除/引用 No.10780-18 - 2022/09/19 (月) 01:39:38 - 散々 >[Re:16] G25さんは書きました : > 1 Mが必要であると言う決めつけはどこから？ むしろ1 Mで効くという知識があるなら、その2/5の濃度で急に全く効果がなくなると考えるのが無茶じゃないか。全か無かじゃないんだから少なくとも静電相互作用を弱める効果はあるはずじゃないか？ bふさんも書かれていますが、DNAのコイル状態とグロビュール状態の変化は相転移現象なので、転移点を境に急に性質が変わります。

(無題) 削除/引用 No.10780-17 - 2022/09/19 (月) 01:22:53 - 散々 市販の核タンパク質抽出用バッファーとして売られているバッファーは、G25さんやおおさんも述べられているように、核マトリクス（クロマチン）を抽出するには不向きです。 市販の核タンパク質抽出用バッファーを細胞に加えてみて、光学顕微鏡で観察してみれば分かりますが、核膜は壊れずに核がシュリンクして、内容物が絞り出されているだろう様子が観察されます（と言っても、全てのメーカーの商品を試したわけではないので、そうでないものもあるかもしれません）。 その様子を見れば、浸透圧を利用して抽出してるのだなと実感すると思います。 ChIP用にはActive Motif社のバッファーを使うのが確実ですが、組成を知ってる人があれば私も知りたいです。

(無題) 削除/引用 No.10780-16 - 2022/09/19 (月) 00:28:38 - G25 >核抽出物を得るLysis bufferは高張掖を使うと説明されていて、高塩濃度との言い方はされていない。 それはあなたの見たプロトコールがたまたまそうってだけでしょう？ じゃあ、高張性を塩以外(ショ糖とか)で達成しているプロトコールがあるか? 私の知る限りでは無と思う。塩でやる限り高塩濃度と高張というのは表裏一体です。高張という表現は著者の感覚によるチョイスで、本当に高張あることに意味があるのかどうか、説明も推測もないじゃないか。 >ヒストンとDNAのイオン結合を解離させるには1M 程度のNaCl濃度が必要だから0.4M NaClではその目的に敵わず、静電相互作用を遮蔽する目的以外で使われている理由があるはずです 1 Mが必要であると言う決めつけはどこから？ むしろ1 Mで効くという知識があるなら、その2/5の濃度で急に全く効果がなくなると考えるのが無茶じゃないか。全か無かじゃないんだから少なくとも静電相互作用を弱める効果はあるはずじゃないか？ 理由があるはずですって言いぱなしじゃなくて、説得力のある考察でもしてみたらどうか。 少なくともあなたの論拠で静電相互作用の弱めるためという言説を否定するのはrationalでは無いと思う。

(無題) 削除/引用 No.10780-13 - 2022/09/17 (土) 04:36:38 - おお >[Re:11] 散々さんは書きました : > 核抽出物を得るLysis bufferは高張掖を使うと説明されていて、高塩濃度との言い方はされていない。 > ヒストンとDNAのイオン結合を解離させるには1M 程度のNaCl濃度が必要だから、0.4M NaClではその目的に敵わず、静電相互作用を遮蔽する目的以外で使われている理由があるはずです。 もともとの目的はヒストンとDNAのイオン結合を解離させず、核マトリクスのたんぱくの溶出を抑えながらも、核内の転写やRNAプロセッシングに関与するものを抽出するということで、そういうフラクションが高濃度で得られるようになっています。転写のばあいGel shiftでヒストンがあればシフトしたバンドがドミナントになってわからなくなる可能性があるでしょうし、スプライシングの反応ではマトリクス成分が阻害的だと聞きます。 だからちょうどよいイオン強度でヒストンなどを溶出せず核たんぱくを溶出できるようになっていて、メカニズム的にはイオン結合の解離でいいと思っています。複数の方法を今まで見てきましたが、hypertonicという言葉を使っているプロトコールは少ないです（hypоtonicは細胞をバーストするのに使うバッファーで使われることが多い割に）。 hypertonicとかかれたプロトコールは確かに散見されますが。

(無題) 削除/引用 No.10780-12 - 2022/09/16 (金) 18:12:18 - bふ 調べたら、みんな固定の条件（時間とか）とか結構、ちゃんと検討してるよ。固定も長くなると、あちこちで架橋が進んで大きな複合体みたいになってしまいたぶん溶けなくなるのではと。なので必要最小限くらいの固定条件が重要ではないかと。 Kitとかダメなの？条件がある程度至適化されてるのではないかなと思う。

(無題) 削除/引用 No.10780-11 - 2022/09/16 (金) 15:34:46 - 散々 核抽出物を得るLysis bufferは高張掖を使うと説明されていて、高塩濃度との言い方はされていない。 ヒストンとDNAのイオン結合を解離させるには1M 程度のNaCl濃度が必要だから、0.4M NaClではその目的に敵わず、静電相互作用を遮蔽する目的以外で使われている理由があるはずです。

(無題) 削除/引用 No.10780-10 - 2022/09/16 (金) 11:01:16 - NL サジェスチョン、大変参考になります、ありがとうございます。 実験の遂行に関しては、文献を参照しながら、ところどころモディファイしながら進めています。ですが、基本のプロトコルを大きく外れてはいないと思っています。 固定された影響でしょうか、核破砕液を加えただけではlysisが不十分で核が残存してしまいます。 ですので、ソニケーションによって核破砕をサポートしているのだと思います。 固定後は final 125 mM Glycineで反応を停止→PBSでwash→細胞破砕 としていたので、ホルムアルデヒドの影響は考えていませんでしたが、HEPESなどへの代替案、参考になります。 SDSの濃度に関しては、薄ければ薄いほどいいだろうという安直な考えです。調べた限り1〜0.1%の間で使用している文献が多かったことに加え、0.1%以上のSDSを入れてもDNAの断片化効率に影響を与えないという文献情報も加味して、0.1%に決定しました。293Tを用いた予備実験では十分ワークしていたのですが、濃度を上げることも有りかもしれません。 2 x 核破砕液の状態では冷やすと沈殿を生じましたが、サンプルに添加後では沈殿なしでした。 幸い、ポジコンとなる領域はたくさんわかっていますので、qPCRの結果を基準に判断していきたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.10780-9 - 2022/09/16 (金) 01:49:55 - おお >細胞破砕液 >50 mM Tris(pH8), 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% Glycerol, 0.5% NP-40, >0.25% TritonX-100 固定後はPBSで洗ってますよね。よく洗っていれば問題ないかもしれませんがTrisはアルデヒドと反応するのでバッファーとして機能しなくなります。Hepesかリン酸バッファーのほうがベターかも知れません。わたしはアルデヒドでクロスリンクしてバイオケミカルな実験をするときは固定のあとはPBSにTris-Glycine Bufferをくわえていちどアルデヒドは中和してます。 >2 x 核破砕液（MNase反応停止液） >10 mM Tris(pH8), 20 mM EDTA, 40 mM EGTA, 0.2% SDS 初期のChip assayのプロトコールでは１％SDSとか使ってたと思う。SDSの濃度が低いのは多分抗体が機能するような濃度（０.１％以下）にTritonなどを含むバッファーで薄めるとき容量が増えるのを嫌ってのことかな。でも抗体でPull downするには別に薄くなってもそんなに影響しないようにおもう。容器はちょっと悩むかもしれないけど。 でSDSいがいのバッファーの組成はまあ１５０mMのNaClを加えてもいいとはおもうが、低温でのSDSの沈殿をかんがえてるのだろうか。LiDSにするとそれは解消すると思う。クロスリンクされたものを拾うという発想なので、ボイルしても理屈上は構わない。ただし結局ロスリンクで溶けづらくなっているのだからどれくらい溶出が改善されるかわからない。 全体的に見て、やはり最初の固定の条件をマイルドにするなどしたほうがいいような気がする。ポジコンとなる領域があるならホルムアルデヒドの濃度をふるなり時間を減らすなりでいくらか条件を振ってベストかなと思える条件を絞り込むといいでしょう。 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3891665/ こちらでも”Optimization of chemical cross-linking time (fixation time). One of the critical steps in ChIP is to capture the DNA–protein interactions within a cellular context, which is achieved using a chemical cross-linking agent, such as formaldehyde ”などと書かれている。formaldehydeいがいにもシスプラチンやUVなどを使ったクロスリンク方法が取り入れられたりもしている。UVはたんぱく同士のクロスリンクが苦手なのでformaldehydeほど不溶化しないかもしれない。

(無題) 削除/引用 No.10780-8 - 2022/09/15 (木) 16:14:18 - bふ ChIPはkitもしくは先行論文なり成書に準じて実験されているのでしょうか。それとも色々なものを見ながら自分なりにやってる感じでしょうか。どちらでもいいと思いますが、EDTAとSDSを含むbufferに懸濁した時点で核はすでに壊れていると思うので、そのあとさらに超音波するのは核の破壊が目的ではないような気がします。これは超音波でDNAを剪断してChIPassayにちょうどいい感じのサイズのヌクレオソーム断片のサイズにするためではないかと思うのですが。この加減が結構重要でいい感じのサイズになるような超音波処理条件を自身で検討し設定するのがカギではないかと。超音波処理条件が弱いとサイズが適切なサイズにならないし、強すぎると分子量の大きいタンパク質の物理的な力による分解が起こります。超音波はキャビテーションでOHラジカルもそれなりの量が生じますのでそれによるDNAやタンパク質の酸化損傷も無視できないですし。

(無題) 削除/引用 No.10780-7 - 2022/09/15 (木) 15:46:17 - NL 早速たくさんの返信をいただきありがとうございます。 勉強不足でお恥ずかしいですが、塩の効果を理解できました、ありがとうございます。 転写因子を対象にしたChIPを試みています。ただ全くの初心者なので手探りで少しずつ検討している状況です。 核の破砕液を含め、現在の大まかなプロトコルを記載します。 1%ホルムアルデヒドで10分固定後、細胞破砕液と遠心により核を分画します。その後、核画分をMNase用のBfで懸濁し、MNaseで断片化後、EDTA、EGTA、SDSを含むbf.（2 x 核破砕液）を等量加えて反応を停止し、超音波によって核を破砕しています(bioruptor, high power, On/Off: 30 sec, 5 cycles)。 細胞破砕液 50 mM Tris(pH8), 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% Glycerol, 0.5% NP-40, 0.25% TritonX-100 MNase bf. 50 mM Tris, 5 mM CaCl2 2 x 核破砕液（MNase反応停止液） 10 mM Tris(pH8), 20 mM EDTA, 40 mM EGTA, 0.2% SDS 超音波破砕後のサンプルをヘモサイトメーターで観察することにより、核の破砕状態を確認しています。超音波の時間を長くしたことがありますが、タンパク質の分解が生じてしまったため、lysis bf.の組成を見直そうかと考えていました。

(無題) 削除/引用 No.10780-6 - 2022/09/15 (木) 14:22:44 - G25 高塩濃度はDNAとヒストンなどとの静電相互作用を弱めて裸のDNAにするためでと思います。DNAあるいはタンパク質を精製するのには良い方法ですが、DNAとタンパク質の相互作用を保っていなければならないChIP（特にクロスリンク処理をしないNative ChIP)には不向きじゃないですか。すくなくとも核膜を壊す効果をねらってのことではないです。 実際にお使いのlysisバッファの組成は？

誤記載の訂正 削除/引用 No.10780-4 - 2022/09/15 (木) 12:30:28 - bふ 誤）強塩基性アミノ酸を多く持つ塩基性タンパク質なので 正) 塩基性アミノ酸を多く持つ強塩基性タンパク質なので

(無題) 削除/引用 No.10780-3 - 2022/09/15 (木) 12:24:15 - bふ クロマチン を構成するHstoneは塩基性アミノ酸（Lys, Arg)など強塩基性アミノ酸を多く持つ塩基性タンパク質なので、中性領域では分子全体として強くプラスに荷電しています(側鎖のeアミノ基がプラスに荷電）。一方DNAはそのリン酸基によりマイナスに荷電しています。そのためHistone とDNAは主にプラスマイナスの引き合い（静電的相互作用）を介してクロマチンの基本構造 を形成しています. ここに高濃度の塩（プラスまたはマイナスイオン)が入るとこの静電的相互作用が弱まり、DNAはHistoneから離れコンパクトだった構造はランダムに伸びきった状態になります。（そのため粘稠になります）ですので高濃度NaClが核を破壊するというよりも、核内のクロマチン 構造を解体するという事で使われます。PFAなどで固定するとHistoneとDNAも共有結合でつながってしまうと思うので、例え塩濃度上げても抽出効率はあまり変わらないように思います。

(無題) 削除/引用 No.10780-2 - 2022/09/15 (木) 12:06:06 - おお イオン強度を上げてタンパク間のイオン相互作用を切断することによって核マトリクスやクロマチンに結合したたんぱく質を遊離させるというのがメカニズムです。 Lysis bf.ってSDSがはいったバッファーじゃなかったっけ。塩濃度上げすぎると沈殿するよ。 個人的には固定条件を少しマイルドにするとかそういうのを検討したほうがいいような気がする。

高NaCl濃度で核が破砕される原理とChIPへの応用 削除/引用 No.10780-1 - 2022/09/15 (木) 11:24:31 - NL 基礎的な質問で大変申し訳ありません。 高いNaCl濃度がどうして核を破砕するのでしょうか。 核内タンパク質抽出の際には、400 mM以上のNaClとTritonやNP40などの界面活性剤で破砕されるプロトコルを散見しますが、はずかしながら原理が分かりませんでした。 実は、ChIPに供するサンプルの調製時、固定サンプルの核破砕効率が悪いため、Lysis bf.の組成にNaClを加えようかと考えました。しかし、原理が分からず、また高塩濃度のbf.で核をlysisしている文献も見つけられませんでした。 高塩濃度のLysis bf.で核を破砕する方法は一般的だと思っていたのですが、それがクロマチンの抽出に応用されないのは何か理由があるのでしょうか。

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