BioTechnicalフォーラム [保存した細胞からのRNA抽出]

保存した細胞からのRNA抽出

No.10778-TOPIC - 2022/09/14 (水) 19:24:40 - さい

いつもお世話になってます

継代時にRNA抽出をしているのですが
数種類の細胞を同日に継代したりする都合上、
細胞の状態で一旦保存しておいて後からRNAを取れたらいいのになあと思う事があります

現実的に可能(収率等に問題ない)方法はありますでしょうか？
　

- このトピックにメッセージを投稿する -

全14件 ( 1 ～ 14 )　前 | 次　1/ 1. /1

(無題)

削除/引用

No.10778-14 - 2022/09/23 (金) 02:26:32 - おお

1000こだと１０ngぐらいですね。。。１０ulにとかしてODで０.０２位、ﾅﾉドロップのSpecificationをみると検出限界はDNAで2.0 ng/ul。測れませんね。

(無題)

削除/引用

No.10778-13 - 2022/09/22 (木) 22:10:51 - AA

便乗質問で恐れ入ります。

ソーターでまとめて集めてらっしゃるとのことですが、どのくらいの数を目処にまとめられていますでしょうか？
現在、ソーターで蛍光タンパク発現細胞だけを集めているのですが、1回の実験で1000－8000細胞程度を集めているものの、うまくRNAを得ることができておりません。(最終溶液10ulほどにして、nanodrop吸光度計で検出できないレベル)
細胞種ごとに違いがあるとは思いますが、最低このくらいはほしいなどの目安を設けていらしたら参考までにご教示いただけると幸いです。

(無題)

削除/引用

No.10778-12 - 2022/09/22 (木) 15:44:47 - ema

ソーターで1回は少量しか集まらないので細胞を数回の実験にわたって集め
TRISOLでの保存で問題なく実験できています。
品質も問題ないです。

(無題)

削除/引用

No.10778-11 - 2022/09/16 (金) 17:58:19 - っっ

Trizol一択ですね。

(無題)

削除/引用

No.10778-10 - 2022/09/15 (木) 08:43:27 - おお

>[Re:8] さいさんは書きました :
> 皆様ありがとうございます
>
> 触れてる人がいないので念のため聞いてみますが、
> 溶解処理する前のペレットの状態(PBSで洗ったもの？)で冷凍するのは微妙でしょうか

なぜ安定性がより保証されている、さほど手間などかからない方法があるのに、精製してもRNAの品質が保証されない方法を取るのかという話です。

凍結切片を作ったりもしないといけないような組織であれば液体窒素にいれて急速に凍結することはあるけど、それでもRNAを取ることがメインの目的ならそうはしない。同様のことをやろうとすると液体窒素を用意して細胞のペレットを漬け込んで凍結してからー８０度という作業になるし、それならTrizolをつかって溶解してしまったほうが手間もかからないだろうし、RNAの分解も極力さけれる。

(無題)

削除/引用

No.10778-9 - 2022/09/15 (木) 08:21:52 - zam

>[Re:8] さいさんは書きました :
> 溶解処理する前のペレットの状態(PBSで洗ったもの？)で冷凍するのは微妙でしょうか

それはトピ主さんの実験目的によります。

RNase Aは-20℃でも活性があると言われていますし、そもそもRNAがDNAに比べて化学的に不安定な物質であり（2'OHの存在）、凍結中の分解反応もあります。そしておそらく実際上問題になるのは融解時のRNAの分解でしょう。

RNAの基本的な化学的性質については生化学の教科書でご確認ください。

このように凍結中の分解や凍結融解による分解の恐れがあるので、それを抑えるためにRNAlaterやTRIzolを入れて凍結させるということです。

とはいえ、単に凍結しただけの細胞から抽出したRNAが使い物にならないかというと、そんなことはありません。

たとえば、ORFさえ取れればよいクローニングが目的ならば、冷凍ペレット由来のRNAでもよいでしょう。出発材料のRNAが分解されていようが、ともかく1個でもクローンが取れればよいわけですからね。

しかし、出発材料のRNAに高いインテグリティーが求められるような実験目的ならば、「微妙」でしょう。

(無題)

削除/引用

No.10778-8 - 2022/09/15 (木) 05:29:14 - さい

皆様ありがとうございます

触れてる人がいないので念のため聞いてみますが、
溶解処理する前のペレットの状態(PBSで洗ったもの？)で冷凍するのは微妙でしょうか

(無題)

削除/引用

No.10778-7 - 2022/09/15 (木) 01:23:31 - おお

継代のときにRNA抽出用のDishを用意して、数日培養後にそこからRNAを回収したほうが良くないか？

Trizolとかその手の試薬はフェノールと強力な変性剤（guanidine isothiocyanate）が含まれているので、それでLysisしてそのまま凍結保存してもRNAは比較的安定な状態で保存できますしよくやる方法だと思います。

またその他のカラムで精製するようなキットのLysis Bufferにはguanidine isothiocyanateが含まれていてRNAはそんなに壊れたりする気がしませんが、具体的にはキットの説明書などを見てください。

(無題)

削除/引用

No.10778-6 - 2022/09/14 (水) 21:19:28 - あの

cellcoverはどうかな？

https://www.funakoshi.co.jp/contents/7571

(無題)

削除/引用

No.10778-5 - 2022/09/14 (水) 21:13:45 - AA

下記のワシントン大学のプロトコル集にセルソーティングで集めてきた後のRNA抽出のプロトコルがありました。それによると、ソーティング後にtrizolで凍結保存することはできるけれど最大50%くらいのロスが生じるようです。
RNeasyキットのRLTだともっとロスが大きいようで、やはり可能なら当日中に抽出してしまう方が良いようです。
ttps://depts.washington.edu/flowlab/Protocols.html

(無題)

削除/引用

No.10778-4 - 2022/09/14 (水) 21:05:33 - さい

細胞の状態って言うのはイメージとしてはペレットの状態、
あるいはほとんど処理をしない(境内のついでにぱぱっとできる程度の処理しかしない)で
冷凍保存等することを想定していました

TRISOLでの保存検討してみます

(無題)

削除/引用

No.10778-3 - 2022/09/14 (水) 19:48:35 - TS

＞差だけではない

さだかではない

(無題)

削除/引用

No.10778-2 - 2022/09/14 (水) 19:47:33 - TS

「細胞の状態」というのがどのような状態か少し差だけではないですが、例えばRNAlaterはどうですか。
あるいは、TrizolやRNA抽出キットのLysis bufferで溶解して冷凍保存も問題なくできると思います。