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(無題) 削除/引用 No.10777-5 - 2022/09/15 (木) 15:37:04 - おお １M NaClはデタージェントが入ったバッファーではデタージェントが分離する可能性があります。デタージェントを使うなら５００mMぐらいまでかなと。 。

(無題) 削除/引用 No.10777-4 - 2022/09/15 (木) 15:30:04 - おお RIPAは何の略かご存知ですか？ Co-IPにも使われることのある（最初はその目的で作られた）バッファーです。完全にたんぱくの相互作用を外すようなバッファーではありません。もちろんRIPAでは見れない相互作用も多々あるようですから強力という感覚はわかります。また、SDSはNIカラムに良くないとされてます（稀に微量加えるといいということがあるようですが）。デオキシコール酸とNiカラムとの相性は今思い出せません。 一層のこと６xHisーFLAG(x３）をつけて、Niカラムで精製、ANTI-FLAGがついたレジンにつけてプルダウン用のバッファーで洗う（この時点でNiカラムについた夾雑物がかなりのぞける）のがいいのでは？ １M NaClはNiカラムを洗うときのバッファーに入れればいいです。Hekとかから精製するんだっけ、Lysisのだんかいでも５００mM位入っていてもいいですし（ただし、クロマチンがゲノムから乖離するぐらいの濃度でもあるのでそこをどうするか、詳しくはあとでよゆうがあれば）。 。

(無題) 削除/引用 No.10777-3 - 2022/09/15 (木) 14:51:12 - OKOK おおさま： アドバイスいただき、ありがとうございます。 Hisタグの弱点として、タグ以外が釣れてくきてしまう可能性があること、勉強になりました。 3xFLAGタグに変える方がよさそうでしょうか。 想定としては、RIPAくらいの強いデタージェントでタンパク結合を切ってやろうかと考えていたため、Hisの方が耐えれるかなと考えていたのですが、FLAGとM2抗体でも大丈夫なのでしょうか。 このような生化学的な実験は行ったことがないので、1M NaClをどのように適応すればよいのかなどの情報がないのですが、なにかよい参考書などありましたらご紹介いただけたら嬉しいです。 よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.10777-2 - 2022/09/15 (木) 01:10:53 - おお Niカラムは非特異のたんぱくを吸着しやすく（理論上Hisが２つ並んでいれば結合するし哺乳動物のたんぱくにはHisが数個並ぶたんぱくは珍しくない）ちょっと不安があるけど、特定のたんぱくだけを見るならネガティブコントロールででないようにある程度条件を探れるのでやれるかもしれない。できれば違うタグを使うか、精製して（Niカラムを使うなら、更にもう一段階精製したほうがいい例えばイオン交換とかゲルろ過とか）コバレントに固定できるレジンを使ったほうがいいかなと思う。 そういうレジンは各社売っているしそんなに特殊な方法でもない。 www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/chromatography/resins/affinity-specific-groups/cnbr-activated-sepharose-4-fast-flow-p-05886 info.gbiosciences.com/blog/epoxy-activated-resin-a-versatile-affinity-chromatography-support info.gbiosciences.com/blog/cnbr-activated-resin-to-immobilize-ligands-for-affinity-chromatography それはともかく質問に関しては、たんぱく間の相互作用を切るという話なので、いくつかやりようがあると思う。 カラム上ならWashの際に 塩濃度を上げる（１M NaClとか） 弱いカオトロピックな試薬をつかう（たとえば抗原と抗体のComplexを抗体の活性を壊さず外すならLiClなら５Mぐらい、MgCl２なら３MとかEthylene glycol ２０％以上とかが使われるので同様のアプローチ10.1101/pdb.prot4276 ） デタージェント pHをふる（Niレジンだったらアルカリにふれると思うので９.５あたりまであげれるかと。またはアミン系の有機溶媒でマイルドなものがありアフィニティーで回収した抗体を溶出させるのに使えるものがあるが、Niカラムとは相性がわるい） それ以外なら 硫安で沈殿させる（塩濃度が高い環境にさらされるので相互作用が解消される。変性するものもあるかもしれない）。ただしアンモニウムイオンが含まれるのでNiカラムに行く前に透析などもう一段階必要。 Size fractionation （ゲルろ過カラム）

プルダウンのベイト作製時の相互作用タンパク質の除去について 削除/引用 No.10777-1 - 2022/09/14 (水) 15:14:46 - OKOK はじめまして。 現在、ある細胞種における、とある膜タンパク質のPDZ結合領域と相互作用する足場タンパク質の探索を行おうと考えています。 既にいくつか相互作用すると考えられる分子にめぼしをつけており、WBでそれを証明したいと考えています。 着目している膜タンパク質に特異的な抗体が市販されていないため、Hisタグ融合タンパク質を用いた検討を考えています。 また、着目している細胞種については、良好な細胞株が存在していないため、組織から取ってくる必要があります。その組織へのきHisタグ融合タンパク質の強制発現系は非常に効率が低いです。 また、大腸菌でのタンパク質発現、タンパク質抽出実験系を、現在持っていません。 そこで、培養細胞（例えばHEK293T）にHisタグ融合タンパク質を強制発現させ、この細胞のタンパク抽出液をHis MagSepharoseに作用させて、目的膜タンパク質のベイトを作成しようと考えています。 このベイトに対して、目的細胞で構成された組織ライセートを適応し、プルダウンするタンパク質を抗体検出しようかと考えていますが、わからないことがありますので、お知恵をいただけたらと考えています。 上記の場合、HEK293Tで既に目的膜タンパク質と相互作用するタンパク質があった場合、それをどのように除去すればよいのでしょうか？インプットなしのコントロールと比較するしか方法はないのでしょうか？ どうぞよろしくお願いいたします。

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