全7件 ( 1 〜 7 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.10773-7 - 2022/09/15 (木) 07:59:40 - モンキーレンチ み様 ありがとうございます。特に培養上の制限はないのでまずは3日程度培地交換してから選択をかけて様子を見てみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.10773-6 - 2022/09/14 (水) 09:07:51 - み 細胞種にもよるだろうけどウイルス添加後、蛋白発現するのに3日かかるものもあるので制限なければ薬剤添加は遅めが良いと思う

(無題) 削除/引用 No.10773-5 - 2022/09/14 (水) 03:21:27 - モンキーレンチ おお様 コメントありがとうございます。感染は 12-well でやっていて播種密度は 5e4 cell/well です。Lenti は lenti-X とパッケージングキットを使いトランスフェクションして培養上清を concentrator で濃縮したものでしたが、濃縮の必要はなかったかもしれませんね。いったん細胞を使って MOI 計算を挟み、MOI 1、10、100 くらいの用量で導入細胞を作ってみようと思います。選択薬剤処理の開始タイミングはレンチ振りかけから 2日にしていますが、これは違和感ないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.10773-4 - 2022/09/14 (水) 02:18:22 - おお Wellのサイズもわからないしなんとも言えないけど、、、 厳密な数字は置いといてある程度感覚みたいなのはあったほうがいいのでは。 例えば２９３Tの培養上清ならしっかりとトランスフェクションできたなら１ulに数百個のウイルスがいるのがたいていだと思います。そうすると濃縮で何倍になったか、検討つくでしょう。 培養細胞なら濃縮せずに培養上清をそのまま使ってもいいくらいだと思います（培養する培地の量の十分の１から半分量）。

(無題) 削除/引用 No.10773-3 - 2022/09/13 (火) 14:45:31 - モンキーレンチ おお様 Titration は未実施です。今回は組み変わった細胞をFACSでソートしてクローンをとれればそれで良いと考え、培養上清から精製したウイルスを 0.5、1、2、4、8 uL/well の範囲で細胞にふりかけてそのまま薬剤選択に持っていきました（各条件3wellずつ用意）。なので正確な数字は把握していないですが、MOIとしては条件を複数振っていることになります。qPCRもしくは細胞を使って titration の数字を出してから細胞取得に進むべきでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.10773-2 - 2022/09/13 (火) 06:29:07 - おお >[Re:1] モンキーレンチさんは書きました : > ウイルス添加量によっては翌日〜翌々日に細胞死や通常の培養では見られないようなaggregateが見られ、アグっていた細胞に薬剤選択をかけてみたところ細胞は一応生存していました（＝レンチはちゃんとつくられており細胞に遺伝子導入が可能）が、アグった細胞をその後の実験（分化など）に使うのは困難と考え、手詰まりになっています。 VSV-Gの影響で細胞どうしが融合してしまうことがあるそうですが、そういう場合は相当過剰量入っているのだとおもいます。MOIは振ってますでしょうか？

レンチウイルス処理した細胞が薬剤処理で全滅 削除/引用 No.10773-1 - 2022/09/13 (火) 05:05:42 - モンキーレンチ こんにちは。表題の通り、レンチウイルスを使って組み換え細胞を作ろうとしています。下記の要領でウイルスふりかけ後に薬剤選択に用いる化合物の濃度を決定し薬剤選択をかけたのですが、細胞が全滅してしまい組み換え細胞の取得に至りませんでした。どこを改善したらよさそうか示唆をいただけるとありがたいです。 細胞：3T3-L1 レンチのコンストラクト（2種）にコードされた薬剤耐性遺伝子：NeoもしくはHygro耐性 プレート：12-well �@組み換えなし細胞を用いて全滅させられる濃度を決定（処理開始から4-10日の間に全滅する最低濃度） �Aレンチウイルスを log phase の細胞に添加（導入試薬としてpolybrene使用、添加量は vehicle も含めて公比2で 4 通り） �Bウイルス添加の翌日に増殖培地に交換、翌々日から�@で決めた濃度の選択薬剤を含む培地で処理→全滅 ウイルス添加量によっては翌日〜翌々日に細胞死や通常の培養では見られないようなaggregateが見られ、アグっていた細胞に薬剤選択をかけてみたところ細胞は一応生存していました（＝レンチはちゃんとつくられており細胞に遺伝子導入が可能）が、アグった細胞をその後の実験（分化など）に使うのは困難と考え、手詰まりになっています。 他に試した方法ですが、L1にはリポフェクションがほぼかからず、安定発現をリポで取ろうとしましたがダメでした。 ヒントになる情報がありましたらお寄せいただけるとありがたいです。よろしくお願いします。

全7件 ( 1 〜 7 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---