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(無題) 削除/引用 No.10772-9 - 2022/09/13 (火) 12:50:10 - 駆け出し研究者 toto様 ご回答ありがとうございます。 承知いたしました。探してみます。 貴重な情報ありがとうございます。 ご回答くださった皆様にも合わせましてこの場で感謝申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.10772-8 - 2022/09/13 (火) 11:23:18 - toto in vitro transcription用のプラスミドで、この目的用にやたら長いpolyAがついたのがあるので、それにいれるのが一般的と思います。addgene等にあるのかどうか知りませんが、国内でも研究者から直接もらえるようです。

(無題) 削除/引用 No.10772-7 - 2022/09/13 (火) 10:33:36 - 駆け出し研究者 おお様 再度のご回答ありがとうございます。 細胞質内での分解を考慮すると、やはりpolyA付加したmRNAを用いる方がよさそうな気がしますね。 大変参考になりました。

(無題) 削除/引用 No.10772-6 - 2022/09/13 (火) 09:47:34 - おお >[Re:5] 駆け出し研究者さんは書きました : > 皆様　 > ご連絡ありがとうございます。 > kit内にpulyA付加反応酵素類が含まれていないことは存じております。 > > 疑問点は、 > in vivo導入の際、polyAを持たずpolyA signalのみを持つmRNAでも機能（細胞内発現）するのか？という点です。 > 期待できないですね。PolyA付加は核でおきます。導入は発現させるためにCytosolに入れるわけですし、CytosolではPolyAのながさでmRNAの安定化制御してます。つまりPolyAが一定の長さ以上ないと分解されます。またCytosolのRNAを核に移行できればPolyAをつけれると思うかもしれませんが、mRNAとなるものを核に運ぶ一般的なメカニズムは存在しません（ウイルスなどなら別です）。もし核内に行っても転写とポリA付加はCoupled していると言われていますので、PolyAがついても効率が悪いものになるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.10772-5 - 2022/09/13 (火) 09:01:14 - 駆け出し研究者 皆様　 ご連絡ありがとうございます。 kit内にpulyA付加反応酵素類が含まれていないことは存じております。 疑問点は、 in vivo導入の際、polyAを持たずpolyA signalのみを持つmRNAでも機能（細胞内発現）するのか？という点です。 ミスリードな文章であったことをお詫び申し上げます。 おお様 テンプレートcDNA下流にAストレッチを載せてIVTするという方法もあるのですね。勉強になりました。

(無題) 削除/引用 No.10772-4 - 2022/09/13 (火) 06:41:27 - おお SP6の反応系ではポリAは付加されません。SP6はbacteriophageで大腸菌にPolyAシグナルによってポリAを付加するメカニズムが存在いたしません。ですからわざわざポリAを付加する反応がいるのです。 mRNAとして導入したい遺伝子のうしろにAストレッチをDNAに組み込んでIn vitro transcriptionするやり方もあるようです。

(無題) 削除/引用 No.10772-3 - 2022/09/12 (月) 23:51:47 - が G25が言うように、IVTの後に、polyA反応は必要ですよ。 もっと優しく教えてあげればいいのに、、、。相手が知らないことを馬鹿にした言い方に聞こえます。

(無題) 削除/引用 No.10772-2 - 2022/09/12 (月) 18:19:52 - G25 polyA反応は必要でしょうかって言ったって、反応系にpoly adenylationに必要なタンパク質複合体のコンポーネントが含まれていないのだから、そもそも起こりようもない。 https://en.wikipedia.org/wiki/Polyadenylation#Mechanism IVTではpoly adenylationは起こらないのだから、poly A tailは鋳型に組み込まれていなければ存在できない。 cDNAにもともと存在するpoly A tailを利用した場合、poly adenylation signalはpoly tailの10 ntくらい上流にあるわけだから、当然、鋳型配列上にに残る。でもIVTでは機能しない。

細胞内発現させるIVT mRNAの３’はpolyA signalでも可能？ 削除/引用 No.10772-1 - 2022/09/12 (月) 17:37:09 - 駆け出し研究者 現在、mouse enbryoへのmRNA導入を行っています。 用いるmRNAをmMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit にて合成しているのですが、この際のpolyA付加について疑問があります。 テンプレートDNA上の発現させたい遺伝子の下流３’端にbGH polyA signalをのせていますが、polyA反応は必要でしょうか。 それともpolyA signalがついているから不要なのでしょうか。 皆様のご回答お待ちしております。

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