全7件 ( 1 〜 7 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.10767-7 - 2022/09/16 (金) 10:23:22 - Karas Cas9と思って回答しますが、恒常的にCas9/gRNAを発現させた場合には「gRNAに認識されない変異が導入されるまで切り続ける」が成立すると思われるかもしれません。 残念ながら実際には「そもそも切断されない」と思われ「いつまで経っても変異が導入されない」ケースがあります。Cas9/gRNAは発現しているので抗生剤セレクションは生き延びますが待てど暮らせどインタクトな配列のままです。 バルクの細胞ですと、gRNA配列と細胞種によって確率は異なりますが、このようにノックアウト細胞とノックダウン細胞とインタクトが混じった状態になっています。 単一クローンを得られる細胞でしたら増やして、出来ればシークエンスして配列を確認後に実験されると憂いが無いです。 ただ単一にすると増殖しない細胞もあり、仕方なしに「〜%で配列がノックアウトされてる」でバルクで実験せざるを得ないケースがあります。そうなるとCas9でノックアウトするよりもsiRNAでノックダウンした方が良いなと判断することがあります。

(無題) 削除/引用 No.10767-6 - 2022/09/10 (土) 20:24:37 - osi 切断後の配列が3塩基欠損などでフレームシフト・ノックアウトに至らない場合があります。 ガイドRNAの配列によっては、そのような変異の出現頻度が最も高い場合もあります。 inDelphiで調べてみると予測できます。 クローン化が必要かどうかは、おおさんご指摘のように細胞によって難易度に違いがあると思います。 下記のように内在性の表面抗原をターゲットにレンチ感染後のフローサイトメトリーでほぼ100%ノックアウトをうたっている論文もあるので、不可能ではないかもしれません。 https://doi.org/10.1038/nbt.3026

(無題) 削除/引用 No.10767-5 - 2022/09/10 (土) 15:03:55 - vv おお様 ご返事ありがとうございます。 レンチであればバルクで問題ないと思っていましたが、 現実にはそうとも限らないのですね、、 クローン化を検討した方がよさそうですね。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.10767-4 - 2022/09/10 (土) 14:59:28 - おお >[Re:3] vvさんは書きました : > おお様 > > ご返事ありがとうございます。 > 抗生剤で死滅しなかったレンチプラスミドが導入された細胞は > 常にその細胞において、今回ターゲットとした遺伝子を切断し続けると解釈していますがいかがでしょうか？ > （安定させるという意味で導入後2週間は培養しました。） 理論的にはそうです。しかしながら前の回答で示した論文でシングルコロニーを拾って来ていて、１個の細胞から実験に使えるほどになるまで増やしているのに発現が消えないクローンがあるのはどうしてでしょうか。理由は推測の域を超えませんので決めれるわけではないですけど、実際にKOが成立しないクローンができてますよね。

(無題) 削除/引用 No.10767-3 - 2022/09/10 (土) 12:04:13 - vv おお様 ご返事ありがとうございます。 抗生剤で死滅しなかったレンチプラスミドが導入された細胞は 常にその細胞において、今回ターゲットとした遺伝子を切断し続けると解釈していますがいかがでしょうか？ （安定させるという意味で導入後2週間は培養しました。）

(無題) 削除/引用 No.10767-2 - 2022/09/10 (土) 11:52:49 - おお まずクローンを拾えばほとんどの細胞でKOが成立していると考えないほうがいい。以下の論文でも半分ぐらいしか成功していない。 https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0228910#sec002 実験でベストでないところがあるともっとひどくなると言っていいとおもう。MOIが低くかったとか、難しい細胞を使っているとか。 また大抵の細胞は２倍体（がんなら２本以上あったりもする）であるのはおわかりになっているでしょうけど、その２本とも潰すのは１本だけ潰れるよりも更に確率が低くなる。やや低下しているのは一本だけ潰れたヘテロの状態の可能性がある。加えてもしKOしようとする遺伝子が細胞の増殖、生理的状態の維持に強く関与しているなら、KOされた細胞は増えないか死滅することもあり増えてきた細胞を見ても両アレルともKOされた細胞が見当たらないなんて言うこともある。

ノックアウト細胞について 削除/引用 No.10767-1 - 2022/09/10 (土) 08:11:57 - vv ノックアウトについて相談です。 レンチで導入し、抗生剤セレクションをかけて安定株を作りました。 WBで評価しているのですが、 ノックアウトと思っている細胞の中に（異なるターゲットエクソン）、 コントロールと 同じレベルのバンドとやや低下しているものが混在しています。 まったくバンドがみえないものはありませんでした。 どのように解釈すべきでしょうか？ 抗体を変えてWBを再度行う予定にしています。

全7件 ( 1 〜 7 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---