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(無題) 削除/引用 No.10763-21 - 2022/09/16 (金) 17:51:58 - っっ 自分の経験則ですが、意外とMutagenesisは遺伝子変異が入りやすいです。 おそらくスーパーコイルのかかったDNAは変異を誘発するのだと思います。 プラスミドのどこかにおかしな異常があるケースを考えて、作り直すのが吉です。

(無題) 削除/引用 No.10763-20 - 2022/09/13 (火) 12:02:16 - おお >[Re:19] zamさんは書きました : > トピ主さんはトランスフェクションのミスは考えにくいとのことでしたが、私ならばその可能性を疑いますね。ですから再実験は一理あると思います。 > > > ちなみに昔の経験談ですが、院生に変異NRAS(G12D)-P2A-EGFP、野生型NRAS-P2A-EGFP、EGFPのみ、の3種のベクターをそれぞれ細胞に導入させたことがあり、初回実験では3つとも光らず、トランスフェクションのミスと考え、再実験させたら普通に3つとも光ったということがありました。 導入に問題がないというコメントを尊重して踏み込まなかったのですが、じつは導入でつまずいてないかと少し思う節があります。それは蛍光蛋白は何を使っているか言及してませんが、細胞内で非常に安定なものが多いです。そのため融合した目的のたんぱく質が分解されても、蛍光蛋白の部分は細胞に残っていたりということもあります。そういうものも見えないとなると、はて、っと思うのです。勿論すべてのケースでそうともかぎらないでしょうけど。 あとは、もともと変異を入れてない状態でそんなに強い蛍光が見れないなら、変異を入れることで局在が制御されなくなれば細胞全体に拡散してしまい非常に弱く見えるか、見えなくなってしまうということも考えられます。

(無題) 削除/引用 No.10763-19 - 2022/09/13 (火) 10:13:07 - zam トピ主さんはトランスフェクションのミスは考えにくいとのことでしたが、私ならばその可能性を疑いますね。ですから再実験は一理あると思います。 また、おおさんが指摘するように、発現量が低下した可能性も考えられますね。変異導入によって翻訳停止や分解。あるいは単にプロモーターの配列がおかしくてとか。 また別の可能性としては、変異導入によってタンパク質による構造や機能の変化が、直接間接的に蛍光タンパク質に影響を与えた可能性も考えられますね。RAS系では聞いたことがありませんが。 ちなみに昔の経験談ですが、院生に変異NRAS(G12D)-P2A-EGFP、野生型NRAS-P2A-EGFP、EGFPのみ、の3種のベクターをそれぞれ細胞に導入させたことがあり、初回実験では3つとも光らず、トランスフェクションのミスと考え、再実験させたら普通に3つとも光ったということがありました。 トピ主さんの参考になるかわかりませんが、とりあえず経験談です。

(無題) 削除/引用 No.10763-18 - 2022/09/13 (火) 01:45:33 - おお >[Re:16] EEEさんは書きました : > 制限酵素で切ってプラミスド長と、インサート長を確認した限りでは何も問題なし。 > サンガーシークエンスによるインサートの配列も問題なし。 > > もはや何がおきているのかわからん。 > トランスフェクションのミスは考えづらい。 > もう一度トランスフェクションしてみるか。 まあわけがわからないことが起こったりして、よくわからないから放置しておくことはなくはないですが、もう少し科学的に詰めていったほうが生産性が上がるかと。 まず、同じ変異を導入したもののクローンを複数拾っているかと思いますが（拾ってなかったら解釈が難しくなりますのでもう１ステップ増えてしまいますが）、それらのクローンですべて同じ結果かどうか。それによってたまたまバックボーンに変な変異が入っていることをかなりの確率で否定できます。 もしどのクローンでも結果が同じなら、それはその変異が入るとたんぱく発現量が極端に減ることを意味しているわけだから、それを追求していけばいいかと思います。最初のデザインでは変異が起こったときのたんぱくの動向（結合活性とか）を想定していたのでしょうけどそうではなさそうなので戸惑っているということであれば、心境は理解できます。 それでもなおかつプラスミドを疑うのであれば（あるいは拾えたクローンが複数ないなら）、変異を導入した部位で配列を読んで確実な部位を制限酵素で切り出して、オリジナルのWild typeのその部分と入れ替えるとバックボーンは機能しているものを使っているのだから解釈を上記のように絞ることができます。

(無題) 削除/引用 No.10763-17 - 2022/09/12 (月) 15:32:36 - AA インサートが切り出せるなら動いている他のプラスミドに載せ替えてみるとかどうでしょうか。 バックボーン側に原因不明の異常が生じてるならそれで解決すると思います。

(無題) 削除/引用 No.10763-16 - 2022/09/12 (月) 11:46:58 - EEE 制限酵素で切ってプラミスド長と、インサート長を確認した限りでは何も問題なし。 サンガーシークエンスによるインサートの配列も問題なし。 もはや何がおきているのかわからん。 トランスフェクションのミスは考えづらい。 もう一度トランスフェクションしてみるか。

(無題) 削除/引用 No.10763-15 - 2022/09/12 (月) 11:44:57 - EEE 制限酵素で切って配列を読んだ限りでは何も問題なし。 インサートの配列も問題なし。 もはや何がおきているのかわからん。 トランスフェクションのミスは考えづらい。 もう一度トランスフェクションしてみるか。

(無題) 削除/引用 No.10763-14 - 2022/09/10 (土) 03:02:36 - おお 制限酵素などでプラスミド全体を確認しているかどうか、 同じ変異のプラスミドを複数のクローンから精製したかどうか、その場合すべてのクローンで同じことが起こっているのか、 配列はどの時点でどのように読んだのか。 基本一つのクローンに一種類のプラスミドと考えてこの手の実験は進めるが、TFしてコロニーを得る場合、複数の種類のプラスミドが導入され一つがドミナントになる過程が含まれるので、コロニーPCRで配列を読んでもそのご配列で認識されたものがドミナントになっているとも限らない。場合によってはコロニーを一度streakingしてもう一度コロニーを拾うくらいの慎重さがあったほうがいい場合もある。極稀に目的のプラスミドが取れたと思って液体培地でプラスミドを増やして精製したところミニプレップで確認したプラスミドが取れずよくわからないものが増えてきたということがある。

(無題) 削除/引用 No.10763-13 - 2022/09/10 (土) 01:10:46 - SYBR master あと、逆鎖も読みましょう。Sanger法は必ず逆鎖も読むべきです。大抵のトラブルは、これで解決します。

(無題) 削除/引用 No.10763-12 - 2022/09/10 (土) 01:02:49 - SYBR master 全長読む必要ないと思うけど、Mutagenesisしたcodingに不安があるなら、その部分は、人工合成遺伝子にして合成して、再構築したほうが早いかもしれません。 沢山の例を知っているわけでは無いけど、codon改変したくらい(数ベースの違い）なら、同一plasmidとして菌体内で保持されそうだし。実際、いまそれでplasmid構築し直しています。

(無題) 削除/引用 No.10763-11 - 2022/09/09 (金) 17:56:17 - momo mutagenesisの方法は？

(無題) 削除/引用 No.10763-10 - 2022/09/09 (金) 17:24:03 - AA cDNA部分というのはプラスミドDNA中のアミノ酸coding regionという意味で使いました。

(無題) 削除/引用 No.10763-9 - 2022/09/09 (金) 15:58:31 - EEE cDNA部分というのはmRNAからsmart法等で、逆転写したpolyAこみのcDNAを解析するということでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.10763-8 - 2022/09/09 (金) 15:44:23 - EEE N末側に蛍光を置いています。全長は長くないため、C末側から読むとRASを超えて、リンカー、さらに蛍光色素の半分くらいまでは読めています。そこまで一切エラーなしですね。 4個プラスミドを作成していて、1個は有名な機能獲得変異。1個は過去にdominant inhibitory変異として報告されている変異、残りの2つが今回解析したいものです。 変異なし、機能獲得変異、蛍光だけのプラスミドはよく光っています。

(無題) 削除/引用 No.10763-7 - 2022/09/09 (金) 14:16:59 - AA RAS(点変異A)-GFP、みたいな融合遺伝子がA-Dまで4種それぞれあるということでしょうか。 私だったら、1個だけおかしいならそれのcDNA部分を全長シークエンス確認してみます。どこかでフレームがずれとかSTOPとかで光らないとかかなと言う印象です。 Primestarは高正確性酵素ですが絶対にエラーが入らない訳では無いので、数をこなしているうちに欠失や置換が起きたクローンが取れることは普通にあります。 でもプラスミド全長読む必要は無いと思います。cDNA全長か加えてプロモーターやpolyA部分くらいでしょうか。 クローニング時点でシークエンス確認をめんどくさいと感じるか、トランスフェクションしてから気づくほうがめんどくさいと感じるかは感性次第です。

(無題) 削除/引用 No.10763-6 - 2022/09/09 (金) 14:00:13 - っっ タンパク質の不安定性の話まで言及しているので、融合遺伝子の話でしょう。 さすがにこれは説明不足と怒っては駄目。 自分の印象ですが、dominant negativeでタンパク質の分解が早くなっていたとしても、発現0というのは違和感ありますね。何かが上手くワークしていない可能性ありに1票。 mutagenesisでは、自分は、遺伝子変異の周囲だけしか読まなかったですね。

(無題) 削除/引用 No.10763-5 - 2022/09/09 (金) 13:44:42 - Ggr ぜんぜん説明が足りない 蛍光タンパク質は融合タンパク質として発現させているのか、IRESなり2Aなりを用いているのか、はたまた別個のプロモーターから発現させているのか、変異を入れた場所はどこなのか、、、

(無題) 削除/引用 No.10763-4 - 2022/09/09 (金) 13:04:46 - EEE 説明不足でした。 同じコンストラクトからそれぞれ4つの異なる塩基置換を導入していて、変異はアミノ酸置換になります。 RAS系の遺伝子です。 シークエンスは、C末側から読んでいて、蛍光色素の領域の途中までは点変異以外は一切変異等は入っていないことを確認しています。 タンパク質の不安定性の可能性もありますでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.10763-3 - 2022/09/09 (金) 11:27:24 - 774R あと4個ってどういう意味ですか？ 4種類のコンストラクトがあるのか、同じコンストラクトから4つのクローンを導入したのかどっち？ ということで、質問やりなおし。

(無題) 削除/引用 No.10763-2 - 2022/09/09 (金) 10:59:32 - 774R 状況がいまいち分かりません。 1kbの確認はシーケンスしたってこと？ 導入って具体的に何をした？ 光らないプラスミドって何？発現系は極秘ですか？

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