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(無題) 削除/引用 No.10762-9 - 2022/09/15 (木) 20:08:41 - toto 慣れてくると、培地を載せたままでyellowチップの先端でコロニーを剥がして吸い取り、96wellに移した中でトリプシン消化して蒔き直すという操作ができるようになりますよ。実体顕微鏡を使えば簡単で、濾紙も要りません。乾く心配がないので、時間かけれていくらでも拾えます。コロニーさえ周りと十分離れていれば、意外と他の細胞でコンタミンは滅多にしません。もっとも細胞に寄りますが。

(無題) 削除/引用 No.10762-8 - 2022/09/12 (月) 23:34:50 - mont １）濾紙をドボンと培養液に落とす時は、上下は気にしません。 ヒラヒラ濾紙が沈むまでに、適当に細胞がバラけるし、ちゃんと生えてきました。落とす前に、おおさんのおっしゃったように、数回振ってから落とすのが良いかも。私は、どちらかと言うとスピード重視で、素早く濾紙をドボンと培養液中に落とし、その代わり、インキュベータに戻す前に、叩いたり揺すったりして、なるべく細胞がばらけるようにしてました。 ２）コロニーの間隔が近すぎると気になるので、なるべく離れた位置（一センチ以上離れている）にあるコロニーを選びます。 ３）ゆっくり濾紙をコロニーの上に乗せていると、シャーレが乾いてくるので、１０センチシャーレに２０〜３０個ぐらいのコロニー数が理想的な気がします。 ４）濾紙から余分なトリプシン溶液を除くため、一度滅菌済みのシャーレに置いて、引きずるように動かします。なんなら、別に滅菌した乾いた濾紙を用意しておき、余分なトリプシン溶液を吸わせてもいいかもしれません。 なんとなく、周りに溶液が染み出しにくそうなのと、コロニーが濾紙に張り付きやすくなるような気がするからですが、実験して確かめたわけではありません。 ５）他の方法に比べて、コロニーの細胞の回収率が良いのか悪いのかは、よくわかりません。回収率のバラツキは大きいかもしれませんが、ほとんどのウェルで細胞が増えてきました。 どちらにしても、後日、顕微鏡化でコンフルエントになったウェルから随時大きいウェルに移して行くので、あまり気にせず進めています。 ６）濾紙を培養液にドボンした後に、顕微鏡化で細胞の有無を確かめてみることをお勧めします。浮遊する細胞や、濾紙の脇から細胞の塊がチョロっとはみ出していたりするのが見えれば、多分うまく行きます。 7) 穴開けパンチの例 https://www.amazon.co.jp/%E7%A9%B4%E3%81%82%E3%81%91%E3%83%91%E3%83%B3%E3%83%81-%E9%87%91%E5%B1%9E%E3%83%9A%E3%83%BC%E3%83%91%E3%83%BC%E3%83%91%E3%83%B3%E3%83%81-%E6%89%8B%E6%8C%81%E3%81%A1-%E3%83%91%E3%83%B3%E3%83%81-%E7%A9%B4%E5%BE%843mm/dp/B07J67KY4J/ref=sr_1_5?__mk_ja_JP=%E3%82%AB%E3%82%BF%E3%82%AB%E3%83%8A&crid=17C78TJLZ17Q1&keywords=Fiskars%2B1%2F8-Inch%2BHand%2BPunch%2BCircle&qid=1662991623&sprefix=fiskars%2B1%2F8-inch%2Bhand%2Bpunch%2Bcircle%2Caps%2C136&sr=8-5&th=1

(無題) 削除/引用 No.10762-7 - 2022/09/11 (日) 09:41:46 - おお 細胞がDishの底についてくれることを期待するわけだから細胞がついている方を下になるのが理想ですが、うまくそういう向きで沈むかといえば半分ふわふわ浮いたりしてそう思ったように定着にないこともあるので、わたしはまずろ紙を培地につけた状態で振って細胞が外れてくれればラッキーだし（ろ紙を落としたあとDishごと揺するというのもありですが）、その後ろ紙を離したあとはどちら向きになろうと運任せです。 ろ紙のばあいは、コロニーの細胞をごっそり全部というのは私の手技的には不可能だし、コロニーがそんなに大きくないと取れてるかなども不安になる。また複数コロニーを取るとき複数箇所にろ紙を置くけど、トリプシンで剥がしたときある程度浮遊して広がる自由度があるため、コロニー間のクロスコンタミネーションがどうしても気になってしまいます。

(無題) 削除/引用 No.10762-6 - 2022/09/11 (日) 03:26:05 - あふ 後学のために伺いたいのですが、ろ紙をドボンするときは、どっちが下ですか？細胞がいるほうが下？それとも上？

(無題) 削除/引用 No.10762-5 - 2022/09/11 (日) 02:11:53 - mont 補足: 濾紙が円形である必要はないので、ハサミで濾紙を小さく切って(2−3ミリ四方)使えば、見た目が悪いだけでワークすると思います。

クローニングリングの代わりに 削除/引用 No.10762-4 - 2022/09/09 (金) 02:57:50 - mont 私はトリプシン溶液に浸した濾紙を、クローニングリングの代わりに使っています。漏れる心配ないですし、簡単で早いです。クローニングリング使ったことありませんが。 １）濾紙（少し厚みのあるもの）を直径３ミリぐらいの円形パンチ（私はAmazonで1000円ぐらいで購入。多分、手芸店でも売っています）を使ってパンチアウトし、乾熱滅菌する。 ２）滅菌済みの円形濾紙を35mmシャーレに入れ、トリプシン・EDTA溶液に浸す（全体が浸る程度、濃度は細胞によるが通常の継代に使う濃度で良い） ３）アルコールで消毒、風乾したピンセットで濾紙を一枚とり、綺麗なシャーレに一度つけて、余分な溶液を取り除き、 ４）PBSで洗ったコロニー（PBS吸引除去後）の上に直接載せます。 シャーレが乾く前に濾紙を載せること。20-30コロニーぐらいなら余裕でできます。 ５）37Cで５〜８分ぐらいインキュベート（時間は細胞によります） ６）濾紙をピンセットでつまんで、濾紙ごと48Wellの培養液の中にドボンと落とす。シャーレを揺らしたり叩いたりして、濾紙から細胞が剥がれるようにする。顕微鏡で細胞の状態を確認すると良い。 ７）濾紙をいれたまま培養 ８）継代。濾紙ごとトリプシン処理、濾紙をwellに残して細胞だけ他の大きいウェルに移す。 商品としては、以下のものが該当します。 無駄に高い気がして、ラボにある濾紙（ウェスタンのウェットトランスファーの時に使ってたやつ）をパンチして使ってみたら、問題なく出来ました。 https://www.sigmaaldrich.com/CA/en/product/sigma/z374431?gclid=Cj0KCQjwpeaYBhDXARIsAEzItbEtjiW4uPH51n4_y-WJ9IfZXglPGurII5EOcZrEnqG78jyiWqzUG3caAv14EALw_wcB

(無題) 削除/引用 No.10762-3 - 2022/09/09 (金) 01:32:57 - おお キーワード：ワセリン（シリコングリース）、滅菌 http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech3/biotechforum.cgi?mode=view;Code=719 https://www.n-genetics.com/products/search/detail.html?product_id=3377

(無題) 削除/引用 No.10762-2 - 2022/09/08 (木) 20:08:25 - 774R ヒントつワセリン

細胞のクローニングリングについて 削除/引用 No.10762-1 - 2022/09/08 (木) 20:05:44 - 細胞 お世話になります。 細胞のクローニングリングについてお伺いしたいです。 pcDNA3.1(+)をトランスフェクトして、その後G418でセレクションしました。 できてきたコロニーをピックアップして安定発現細胞株を樹立する予定です。 大きなコロニーができてきたので、クローニングリングを購入し、使ってみましたが、上手く使えず困っています。 まず、10 cm dishから培地を除き、PBSで軽くリンスしました。 その後、クローニングリングをコロニー上に置き、その中にトリプシンを加え、しばらく静置しました。 ところがそのトリプシンが少しずつ漏れてきてしまい、しかもその中へ培地を加えてピペットする際にグラグラ動いてしまい、とても難しく感じました。 正しいクローニングリングの使い方ができていないのだと思います。 工夫をご存知の方がいらっしゃいましたら、ご教授いただけますと幸いです。

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