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(無題) 削除/引用 No.10759-9 - 2022/09/07 (水) 18:48:52 - G25 遊離のEtBrは正電荷なのでこれが逆に流れているのを見ているのでしょう。 変性ゲルでMOPSバッファということなのでホルムアルデヒド変性ゲルですね。 TAKARAのloading bufというのはそれ用のローディングバッファ（HCHO, formamide,MOPSを含む）でしょうか。DNA泳動用の非変性ローディングバッファなら理屈にあってません。 RNAは一本鎖なのでほとんどインターカレーションは起こりません。RNA泳動のEtBr染色は泳動後に変性剤をよく抜いてから後染めにする（二次構造による部分的な二本鎖にインターカレーションが起こる）のが古典的。 わりと最近でてきたもうちょっとソフィストケートされた方法は、ホルムアルデヒド変性用のローディングバッファーに少量のEtBrを入れて、常法通り55-70℃で加熱変性する方法。EtBrがインターカレーションによらない結合（ホルムアルデヒドにｙほる架橋？）でRNAに結合して、泳動後もバッチリ染まります。 これもたしかAGPC法（Trizolはその製品版）を考案したChomczynskiの考案。 EtBr濃度が高すぎるとRNAの移動度に影響がでるので注意（たしか最大0.5 ug/uLだったか。原著論文を見つけて確認して）。 ホルムアルデヒド変性ローディングバッファーを使うと、TAEバッファなど非変性ゲル電気泳動でもRNAがかなりきれいに分離するという点もおすすめ。 インターカレートしたEtBrがDNAと一緒に移動するので（でもEtBrはだんだん抜けて逆向きに流れているので染色は薄くなっていく）、DNAサンプルにEtBrを入れて泳動するのはありだけど、RNAじゃ最初からEtBrは強い結合していません。ひょっとして、それでもRNAが見えるくらい、大量のEtBrを混ぜてる？

(無題) 削除/引用 No.10759-6 - 2022/09/07 (水) 14:52:36 - M1王 > 光らないのではなく蛍光強度が核酸の結合により数十倍になるという話です。RNAだとDNAほど蛍光強度が上がらないでしょうから、相対的に強く見えるはずです。 そういうことだったんですか！勉強不足でした。 おお様、が様ありがとうございました。 EtBrの濃度を色々振ってもう一度泳動を試してみます。

(無題) 削除/引用 No.10759-5 - 2022/09/07 (水) 14:07:27 - が おおさんがおっしゃるようにEtBrが正体です。同じ経験あります。 単純にEtBrを過剰量入れすぎ。 後染めもチョイス

(無題) 削除/引用 No.10759-4 - 2022/09/07 (水) 12:35:04 - おお >[Re:3] M1王さんは書きました : > おお様ありがとうございます > > 核酸にインターカレートしてないEtBrは光らないはずだし、 光らないのではなく蛍光強度が核酸の結合により数十倍になるという話です。RNAだとDNAほど蛍光強度が上がらないでしょうから、相対的に強く見えるはずです。 Wellのところでゲルを切ってはどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.10759-3 - 2022/09/07 (水) 12:23:54 - M1王 おお様ありがとうございます 核酸にインターカレートしてないEtBrは光らないはずだし、インターカレートしてたら下に流れるのでは？と思っていたのですが、やはりEtBrが正体なのでしょうか。 どうにか上部のスメアをなくす方法はありませんかね…。

(無題) 削除/引用 No.10759-2 - 2022/09/07 (水) 11:52:47 - おお EtBrが逆走するのでそれを見ているのではないでしょうか。

total RNA電気泳動でwellの上部にスメア 削除/引用 No.10759-1 - 2022/09/07 (水) 10:45:10 - M1王 ヒト細胞から抽出したtotal RNAを変性アガロースゲルで電気泳動すると、ほぼ毎回サンプルを入れたwellから上部(陰極側)にかけてスメアが発生します。 タンパク質や核酸が逆走するとは考えにくいのですが、これは塩か何かによるコンタミでしょうか？ RNAの抽出から泳動までの大まかなプロトコルは TRIzolで溶解→クロロホルム抽出→イソプロパノール沈殿→70%エタノールでwash→3分風乾→滅菌水を混合 ↓ RNAサンプル、MOPS buf.、EtBr、TAKARAのloading buf.を混ぜて65℃で5分ボイル→変性ゲル(ホルムアルデヒドのみ加えたもの)でサンプルを30分ほど泳動 です。

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