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(無題) 削除/引用 No.10754-7 - 2022/09/12 (月) 15:19:03 - ままま ご回答頂いた皆様、返信が遅くなり申し訳ありません。 多くのご教授を頂きありがとうございます。 ＞あふ様 　多くのヒントを頂きありがとうございます。やはり、血清入りの培地で洗浄した方がいいのですね。洗浄は回数を重ねるものだと思っておりましたので、多量の培地で洗浄する方法は思考外でした。大変参考になります。 ＞zam様 　おっしゃるとおり、WGAの蛍光強度が、染色して単体で培養した時よりも、染色して他の細胞と共培養した時の方が薄くなっておりました。もしや、とは思っておりましたが、移行している可能性がかなり高そうですね。 染色される原理や染色剤の性質について、勉強が足りていないことを痛感いたしました。 皆さまから頂いた助言を参考に、染色剤の選定等試してみます。

(無題) 削除/引用 No.10754-6 - 2022/09/07 (水) 12:26:33 - おお >[Re:4] おおさんは書きました : > そういう目的でつかえる色素も売られていると思ったけど。 www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-analysis/cell-tracing-tracking-and-morphology/cell-tracking.html#prd いちど細胞内に入ると細胞内にトラップされて出てこないので他の細胞と共培養しても、目的の細胞を見つけることができるそうです。 なん社か同じような特性を持つ色素を売っているようです。 biotium.com/tech-tips/tech-tip-using-viafluor-se-stains-for-cell-tracing-and-co-culture/

(無題) 削除/引用 No.10754-5 - 2022/09/07 (水) 01:09:57 - XDFT もし培養中にGAP junctionとか形成されれば、細胞間で低分子物質の移動は普通に起こります。またトンネルナノチューブ（それに似た細胞間連絡架橋は他にもいろいろあります）と言うのがあってオルガネラみたいにもう少し大きいものも移動も起こります。WGAはレクチンなので相手は基本的に細胞膜の糖鎖だと思いますがその複合体がendocytosisとかで細胞質に入ればendosomeの形のまま同様の機構で細胞間を移動することもあってもいいのではないかと思います。同様にヘキストもDNAに結合しきれない分はフリーのまま細胞間を拡散して動いていくのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.10754-4 - 2022/09/06 (火) 23:15:51 - おお 親和性が高いだけで、くっついて離れないのとは同義ではない。徐々に拡散していくだろうから最初ラベルしてない細胞にうつっていても不思議ではない。 そういう目的でつかえる色素も売られていると思ったけど。

(無題) 削除/引用 No.10754-3 - 2022/09/06 (火) 06:54:32 - zam >[Re:1] まままさんは書きました : > 長時間培養していると、染色剤が他の細胞にも移行して染色してしまうのでしょうか。 理屈の上ではそうです。 まず、WGAもHoechst33342も非共有結合ですから、結合と解離を繰り返しています。程度はともかく。 （抗体：抗原に比べてWGA：GlcNAcやHoechst33342：DNAは解離しやすいと言えるでしょう。もちろん結合の仕方もリガンドも反応条件も異なるのでカイネティクスパラメーターを単純比較できないことは言うまでもありませんが）。 さらにHoechst33342は膜透過性がありますし、WGAは細胞膜（上の糖）に結合するものですから、特段の処理をせずとも細胞間を移行可能です。理屈の上では。 通常は染色処理後すみやかに観察するので、染色剤の解離→再結合は無視できます。 しかし長時間置いた場合には、無視できないレベルになるのではないでしょうか。 理屈の上では上に書いたとおりですが、では実際どうか？ トピ主さんのような実験をしたことがないので、何とも言えません。 それに、もし移行のせいだとすると、一個の細胞当たりの蛍光量が減って全体的に薄くなるような気もするのですが。その辺は実際どうだったのでしょうか？ in vitroの実験では何かを足したり引いたりして、結合や解離のパラメーターを変えることはできますが、生細胞の培養では何とも。

(無題) 削除/引用 No.10754-2 - 2022/09/05 (月) 18:42:07 - あふ これらは一つのアイデアですが、私ならこんな感じでトラブルシュートすると思うです。 ・1回目の洗浄は血清入り培地で WGAを使ったことがないのでよくわかりませんが、なんとなく血清入り培地のほうが結合してない色素を吸着してくれるイメージ（すくなくともPKH26はそうだった） ・混合した10分後に観察してみる これでどう見えるかは重要かも？　もしこれで全部が赤と青に染まってるなら、色素のオーバーフローか、蛍光顕微鏡の設定が悪い気がする。 ・各洗浄はできるだけ大量の培地を使用 洗浄時の残留色素がオーバーフローしている可能性を考慮。意外と色素って薄めまくっても染まっちゃたりするんだよね。 例えば、【1.5mLのエッペンドルフチューブに1mLの色素を入れて染色→遠心、上清吸引、1mLの無血清培地（in epp tube）でwash x 3】という手順でやっているんだとしたら、【1.5mLのエッペンドルフチューブに1mLの色素を入れて染色→遠心、上清吸引、50mLの無血清培地（in 50mL Falcon tube）でwash x 3】でやってみる。 それでも理論通りに行かないなら、色素のオーバーフローではなくて、培養中に色素が外れて、別の細胞に移行してしまっている可能性が高そう。 ・細胞の生存率を確かめる 死んだ細胞から色素が外れて、他の細胞にくっついてる可能性も否定できないかも。特に無血清培地で培養しているみたいだし、細胞が死んでても不思議はない（細胞によるけど）。というわけで、最初と12時間後の細胞数とか生存率を数えてみる。 ・色素を変える いろいろやってみて、うまくいかなそうなら、原因の究明は一旦ペンディングにして、色素を変えてみるのも良さそう。PlasMem BrightとかPKH26、PKH67とかの別のものでLet's try

長時間培養による染色剤の細胞間移行の可能性について 削除/引用 No.10754-1 - 2022/09/05 (月) 17:22:41 - ままま いつも参考にさせて頂いております。 現在、2種類の細胞をそれぞれ異なる色の蛍光色素で染色し、それらを1つのdishに1対1の割合で共培養させ、12時間後に蛍光顕微鏡で蛍光を観察する実験を行っております。 詳細といたしましては、 ・細胞をトリプシンで剥離させて回収し、浮遊状態で染色する。 ・片方の細胞はWGA 1μg/mL（赤色）で37℃、10minで染色し、もう片方の細胞はHoechst33342 5μg/mL(青色）で37℃、10minで染色し、両方を無血清培地で3回洗浄する。 ・各細胞を1対1の細胞数割合で混合する。 ・無血清培地を加えたdishに播種し、浮遊状態で12時間培養した後、顕微鏡にて蛍光を観察する。 です。 理論的には、WGA（赤）で染まった細胞が半分、Hoechst（青）で染まった細胞が半分になるはずなのですが、 蛍光顕微鏡で観察してみると、ほぼすべての細胞が赤にも青にも染まっています。 染料が残っているのかと思い、十分に洗浄していますが問題がよくなりません。 長時間培養していると、染色剤が他の細胞にも移行して染色してしまうのでしょうか。 また、無血清培地では染色反応が停止されないのでしょうか。 ご教授のほどよろしくお願いいたします。

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