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(無題) 削除/引用 No.10752-6 - 2022/09/07 (水) 05:16:21 - おお karyotype とその細胞名で検索してみるとどうでしょうか、むかしのゲノムのマイクロアレーでどこが増幅されていて、一方の染色体が欠失していてとか調べるっていうのがあったのでそういったデーターも取られているかもしれません。 最近はPCRで増やして配列をよんでいろいろな波形が重なっているデーターから１つ１つの配列を抽出するというソフトも有るようです。 もう一つ裏技的なやり方はもしIndel挿入部分に制限酵素認識サイトがあるならIndelがはいるとその認識部位は潰れるわけだから、すべてのアレルが潰れていたならPCR Productsをその制限酵素できってもフラグメントができないはず。 配列を読まないでいいかはどこまで認められているかわかりませんが、１２個も調べれば４本あってIndelが入ってないのにその配列が見当たらないp値は５％より低い（多分）のでそのくらいでもいいのではないかと思いますがどうでしょう。まあ余裕があればもう少し増やしてもいいでしょうけど。

(無題) 削除/引用 No.10752-5 - 2022/09/06 (火) 13:09:34 - seventh PCRで増える領域の変異を見るならPCR断片を読んで波形を見れば良いのでは。 ヘテロindelがあればそこから波形がずれて重なって行くので。 マルチコピーだったとしてはもすべてホモかどうかは確認できます。

(無題) 削除/引用 No.10752-4 - 2022/09/05 (月) 20:23:57 - 独り言 シークエンスまでを要求することは少ないかと思います。余裕があればやる程度で。 むしろオフターゲットのほうが気になるので、野生型の発現で表現型がレスキューできていることのほうが重要かと。

(無題) 削除/引用 No.10752-3 - 2022/09/05 (月) 19:33:08 - 細胞株 独り言様、早速ありがとうございます！ 独り言様はノックアウトの確認のためにゲノムの配列は読まなくても良いという考えでしょうか？ 実はすでにウエスタンは行っておりまして、複数のノックアウト体を取れていますが、一応どんな変異かを論文にする上で聞かれるかなと思って塩基配列を読もうとしていましたが、もう2022年の今、そんなことは聞かれないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.10752-2 - 2022/09/05 (月) 17:36:57 - 独り言 同じ遺伝子領域をもつ、２倍体の正常細胞と一緒にゲノムをリアルタイムPCR で定量比較する。その場合、他の領域でよいので、数が分かっている染色体がコントロールで必要だが。 お作法的な方法なら、M期の細胞をスライドに撒いて、karyotype testして染色体数を顕微鏡でみればよいような。 ちなみに、どちらにしてもCRISPRのKOクローンをシークエンスで確定するのは手間がかかる。例えば、２本に同じ変異が入っていたら見分けつかないし。 点変異導入ならしょうがないが、KOならタンパク質発現見たほうがよいのでは。なんだかんだ、ＰＣＲよりも楽だし、確実。

細胞株の倍数体の知り方 削除/引用 No.10752-1 - 2022/09/05 (月) 17:01:25 - 細胞株 初歩的な質問なのですが、教えていただきたいです。 今細胞株でとある遺伝子のノックアウトを取ろうとしていますが、できたクローンの遺伝子型をDNAシークエンスでみようと思います。その際にはゲノム編集部位が入るようPCRをかけ、TAクローニング後に、各大腸菌クローンを読む予定ですが、いくつ読めばいいのか悩んでいます。 もし２倍体なら、多くても2種のDNA型がみられるはず。 ただ癌細胞株の場合、２倍体である保証はなく、多倍体の可能性の方が高いと思います。 そこで今扱う細胞が何倍体なのかを知る手段を知りたいです。 ご存知の方がいらっしゃいましたら、教えてください。 よろしくお願いします。

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