BioTechnicalフォーラム [アフィニティークロマトグラフィー]

アフィニティークロマトグラフィー

No.10749-TOPIC - 2022/09/04 (日) 18:00:31 - 初学者

Hisタグ融合タンパク質のアフィニティークロマトグラフィーに関しての質問です。
最近、Hisタグ融合蛍光タンパク質のアフィニティクロマトグラフー(使用カラム:HisTrap)に取り組んでいるのですが、うまくいきません。
素通り画分では非常に高いUV値が得られるのですが、溶出画分ではUV値の上昇が見られません。そこで、分画された溶液をホワイトトランスイルミネーターのUVに当てて観察した所、素通り画分と洗浄画分の始めは蛍光を発しており、その後、蛍光を発さなくなり、溶出画分になると再び蛍光を発し始めました。
これは、カラムの吸着量が低下しているということでしょうか。この場合、硫酸ニッケル溶液によるリチャージで改善可能でしょうか。その他考えられる原因がありましたら、ご教授お願い致します。
　

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No.10749-5 - 2022/09/05 (月) 10:16:33 - noname

平衡化した時のカラムの色は水色っぽいですか？白くなっているようでしたらNiがリークしてしまっているのでリチャージが必要です。

吸着時のバッファーのpHも重要です。マニュアルではリン酸バッファーでpH7.4の例が良く掲載されていますが、私はHisTrapならトリスでpH8程度になるようにバッファーを調製しています。

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No.10749-4 - 2022/09/05 (月) 05:58:14 - おお

あと吸着しているが、溶出できてないとか。

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No.10749-3 - 2022/09/05 (月) 05:55:24 - おお

おなじカラムを使用してて、収量が低下したのならカラムの劣化はあると思うのでリチャージを含む再生をするのは選択肢です。

そうでばければ、原因は他にあるでしょう。たんぱくのHISの部分が露出してない、削れている、吸着時のバッファーにカラム結合を阻害するものが残っている。など。

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No.10749-2 - 2022/09/05 (月) 01:40:48 - たこ

カラム側がヘタっている可能性もあるかもしれませんが、単純にアプライ量が多すぎてキャパオーバーということはないでしょうか？
大昔に当該カラムを使用していた時には、使う前には必ずNiを流してからやっていました。
ぞんざいに扱う人もいて信用できなかった部分もありますが。