全7件 ( 1 〜 7 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.10744-7 - 2022/09/05 (月) 13:26:35 - asan >・目的のplasmidを増やす目的で大腸菌にtransformationし、できたコロニーからとったplasmid ・2つのplasmidを同じ制限酵素でdigestして、つなぎ合わせて大腸菌にtransformationし、できたコロニーからとったplasmid どちらもPCR等の人工的にエラーが生じやすい方法を用いてないので基本的には個別のサンガーシーケンスは出しません。ただ、後者の制限酵素によって切断後らいゲーションを行なった場合は複数の制限酵素によって生成物の向きと入り方を確認はします。 ごくたまに、大腸菌で増幅する過程で組み変わってしまったりリピート配列が抜け落ちることはもちろんあるでしょうが、生体内で合成したDNAはPCRによって増やす方法に比べて圧倒的に正確性が高いです。PCRは原理上初期エラーが入るとそれがかなりの割合に含まれてしまうこともあるので細かい塩基配列のエラーが重要な場合は、シーケンスによって確認は基本必要です。 サンガーシーケンスなんて、昔は数百ぐらいしか読めなかったのでKOマウスを作ったりDNAによる形質転換で癌遺伝子を探してる時代はそもそも論としてBAC等の配列は基本制限酵素処理で済ませてることの方が一般的だったと聞きます。

(無題) 削除/引用 No.10744-6 - 2022/09/03 (土) 21:25:35 - JIJII westernでサンプルをアプライしたら必ず2時間待ってからでないと泳動してはいけないとか、極めて個性的な実験をされる人をたくさん見てきましたが、クローニングの際に制限酵素処理してインサート確認をしないで進めるという人にはまだ会ったことありません。

(無題) 削除/引用 No.10744-5 - 2022/09/03 (土) 09:33:19 - zam >[Re:1] P/Sさんは書きました : > ・目的のplasmidを増やす目的で大腸菌にtransformationし、できたコロニーからとったplasmid > ・2つのplasmidを同じ制限酵素でdigestして、つなぎ合わせて大腸菌にtransformationし、できたコロニーからとったplasmid > 以上の２つは目的のplasmidがとれていると思ってチェックせずに先に進めるのが一般的でしょうか？ ノーチェックは一般的ではないと思いますよ。 ノーチェックでよいとする合理的理由がない限り、チェックは不可欠です。 チェックは制限酵素かPCRで事足りると思います。 私の場合ですが、 1つ目の事例に関しては、異なるプラスミドが取れてしまったことは今までありませんが、それでも必ずチェックします。 2つ目の事例に関しては――「同じ制限酵素でdigestして」の意味が図りかねますが、それはさておき――、切り貼りした場合は目的外の産物が取れることがあるので、必ずチェックします。 チェックするにもコスト（費用、時間、手間など）が掛かりますが、その後の実験のコストの大きさを考えると、チェックのコストは僅かでしょう。 しかし、その僅かなコストを惜しんでチェックしない人はいるかもしれませんね。 ノーチェックで実験を進めたい人には「自己責任で好きにすれば」と言いたいところですが、その後の実験を棒に振ったり、他の人々が迷惑を被るかもしれないと思うと「好きにすれば」とも言ってられませんね。

(無題) 削除/引用 No.10744-4 - 2022/09/03 (土) 02:20:25 - PCR 両方とも制限酵素チェックは必ず行います。一般的かどうかという話で言えば、教科書的には全ステップそれぞれで確認を行うように書かれてると思う。 コロニー拾っての培養はAmpなりKanなりを入れて培養してるんだから目的のプラスミド以外増えないはずだ、と確認せずにMaxiまでやって細胞にトランスフェクションするところまで進めた学生がいた。結果が出ずに悩んでいたところ、プラスミドを確認するよう言われて、調べたら目的プラスミドとは全く違うものだったことが発覚。当然かなりの時間を無駄にした。こういう事例みたことあります。 ちょっとトピずれの話だけれど、ちょっと前に「最近の若者はIn-Fusion等でコンストラクト作成するので、制限酵素が何か知らなかったりするんですよね〜、制限酵素を使ってコンストラクト作成するようなのは年寄りしかいませんからね〜」で始まる新時代のコンストラクト作成方法云々という記事があった。コンストラクト作成法に制限酵素での切った貼ったが使われなくなってきているのは確かにそうかもしれないが、コンストラクト確認の王道は今現在でも制限酵素処理だろうにこの著者はアホじゃなかろうか、と思ったっけ。まさか、今時の若い人は本当に制限酵素が何か知らなかったりするのだろうか？そんな訳無いと思うのだが。

(無題) 削除/引用 No.10744-3 - 2022/09/03 (土) 00:03:07 - が 両方とも制限酵素チェックのみ サンガーシーケンスなし

(無題) 削除/引用 No.10744-2 - 2022/09/02 (金) 23:49:28 - おお >[Re:1] P/Sさんは書きました : > いつも勉強させていただいております > > ・目的のplasmidを増やす目的で大腸菌にtransformationし、できたコロニーからとったplasmid 制限酵素で確認します。 > ・2つのplasmidを同じ制限酵素でdigestして、つなぎ合わせて大腸菌にtransformationし、できたコロニーからとったplasmid ライゲーションや、その他のテクノロジーでConstructionを作ったとき、できたコロニーが目的のプラスミドを持っている確率は１００％にはなりません。８０％いったら上出来です（もちろんもっといい確率で取れることもありますが、ふたをあけるまでわからないし、９５％でも２０個に一個ははずれ）。なかには難しくてコロニーハイブリダイゼーションまでやっ拾ったとか言う話も聞いたことがあります。

コンストラクトの確認 削除/引用 No.10744-1 - 2022/09/02 (金) 18:28:12 - P/S いつも勉強させていただいております。 クローニングをした際には、ちゃんと目的の配列が挿入されているかを制限酵素処理やシークエンスで確認すると思います。例えば、PCR産物をpBlueScriptにいれたり、IVM(in vitro mutagenesis)をした際にはPCRのエラーがないかをシークエンスで確認します。 次の場合はみなさん制限酵素処理やPCRで目的のplasmidがとれているのかの確認ってされてますでしょうか？ ・目的のplasmidを増やす目的で大腸菌にtransformationし、できたコロニーからとったplasmid ・2つのplasmidを同じ制限酵素でdigestして、つなぎ合わせて大腸菌にtransformationし、できたコロニーからとったplasmid 以上の２つは目的のplasmidがとれていると思ってチェックせずに先に進めるのが一般的でしょうか？ 個人的にはPCRをかけたら確認の作業が必要であるのかなと思っています。

全7件 ( 1 〜 7 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---