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(無題) 削除/引用 No.10736-6 - 2022/09/03 (土) 22:16:04 - K アクチンはたぶん変動が少ないだろうと誰か偉い人が昔、内在性コントロールに使い始めたのをなんとなく踏襲しているだけで、様々な条件下でアクチンの発現（他の内部標準も同様）が増減しないという科学的な根拠があるわけでないので、異なる複数の（ここ重要）内部標準遺伝子を基準にしてactin遺伝子の発現変化を見てみたらどうでしょうか。（内部標準の遺伝子の発現が変化しているとしたら、結果の解釈を大きく誤るということになるし、actinの発現変化が起きてるならそれはそれで重要な知見になるし）ここは十分時間かけてちゃんと調べてもよいのではないかと思います。私は昔、ある条件下でGAPDHの発現が大きく減ることを偶然に見つけました。で、目的タンパク質の発現をチューブリンで補正した時とGAPDHで補正した時では結果が逆になりました。それで内部標準の危うさを実感しました。 内部標準遺伝子・タンパク質を標準に使うことの妥当性については最近議論が出ているようです。（タンパク質では総タンパク質染色で補正してる例も徐々に散見されるようになりましたし。）

(無題) 削除/引用 No.10736-5 - 2022/08/31 (水) 02:23:10 - おお 細胞の状態は我々には見れないのでわかりませんが、RNA精製の過程にしろ、細胞の状態にしろqPCRで発現を評価するような状態ではありません。 テクニカルにはRNAは分解されやすく精製の過程で分解が進むことがたまにあります。分解されてもRNAはRNAなので精製されたものはUVなどの吸収では何らインタクトのRNAと違いが見いだせないでしょう。 できれば同じ実験を繰り返すこと（精製過程で分解されたりされなかったりで結果が大きくブレるのでそれでわかるはず）。十分にRNAがあるなら電気泳動でrRNAを検出して分解の可能性を否定することをおすすめします。 ノーザンが主流のときはrRNAをエチブロなどでそめてInternal controlとすることが大抵だったので、これが分解されて泳動パターンがかわるとデーターとして使えなかった。RTーqPCRでもそういうのはデーターとして使えないと思ったほうが良いのだけど、なんだかqPCRが手法として普及するにともなってそういうことを無視するケースが大抵になっているような気がする。 わたしに分子生物学で指導してくれた人のひとりは、各ステップごとにうまく行っているかしっかり確認しながら進めるよう助言してくれた人がいて、随分それで実験が確実に進むようになったなあという感覚がある。どこがうまく行ってないか印象、あてすっぽ、思いつきだけで決めていると対処方法もちぐはぐで一向にいい方に向かわないことを意識してほしいと思う。

(無題) 削除/引用 No.10736-4 - 2022/08/30 (火) 22:07:52 - み >[Re:3] 初心者Nさんは書きました : > RNA抽出終了後にNanodrop liteで計測を行っていますが、A260/A280は1.9-2.0の間で収まっています。 分解されていても吸光度はそのように出る。アクチン以外の複数遺伝子も他の細胞と比べて軒並み低いなら分解の可能性を考えます。 RNAをアガロースゲル泳動くらいしてリボソーマルRNAの出方くらい見れば分解は否定できるでしょうに。

RNAの質について 削除/引用 No.10736-3 - 2022/08/30 (火) 17:15:17 - 初心者N RNA抽出終了後にNanodrop liteで計測を行っていますが、A260/A280は1.9-2.0の間で収まっています。RNA回収はIsogenを用いて回収を行っています。

(無題) 削除/引用 No.10736-2 - 2022/08/30 (火) 11:20:24 - み RNAの質に問題ないのですか？

LNCaP細胞のβアクチン 削除/引用 No.10736-1 - 2022/08/30 (火) 11:06:04 - 初心者N 理研から購入したLNCaP-FGC細胞を扱っています。この細胞は数年前に購入されており、自身が研究室に所属する前から培養されているものです。 最近、qRT-PCR法を45サイクルで行っているのですが、βアクチンのCq valueが30付近で出てきます。ほかの癌細胞では20付近で検出されるのですが、これは細胞の状態がおかしくなっているからこのような状態になっているのでしょうか？ 他の細胞と比較してあまりにも増幅が弱いので不安です。

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