BioTechnicalフォーラム [免疫沈降後に外れるタグありますか。]

免疫沈降後に外れるタグありますか。

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No.10725-TOPIC - 2022/08/24 (水) 17:44:14 - ロボット

とある抗体を持たない蛋白をタグを用いて免疫沈降で回収し、回収した蛋白を抗原として抗体を作る計画です。タグ外すことできればより抗原性が良いと思われるので、免疫沈降後に外せるようなタグがあれば、ご教授のほどよろしくお願い申し上げます。
　

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No.10725-8 - 2022/08/25 (木) 19:09:20 - G25

「エピトープタグをつけて免疫沈降する」は既定路線なの？
GST, MBP, Hisなどのタグをアフィニティー精製するほうがコスパがいいと思うけど、それをしった上で決めたんだろうか。FLAG, Myc, HAなどのエピトープタグでモノクローナル抗体をつかって釣り上げる方法も普及しているけど、抗体のコストが高いしあまり採用したくない手段。

アフィニティータグにしてもエピトープタグにしても、タグを切り離すのに使われる配列特異的プロテアーゼはいろいろあるから(古典的なのではFactor Xa、Thrombin, Enterokinaseなど）それにあわせてペプチドを設計したらいい。

>タグ外すことできればより抗原性が良いと思われるので、
なぜ？　抗原性の良し悪しは関係ないと思う。
タグ配列に対する抗体もできてしまうのを気にする人はいるｌ．

(無題)

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No.10725-7 - 2022/08/25 (木) 00:53:42 - おお

そのたんぱく質の抗体なら、バクテリアでGSTなどのシステムを使うのが常套手段だと思うけど、わざわざIPするのは、複合体に含まれるものの抗体も狙っているのか、、、立体構造を認識したり、修飾された部位を認識したりする抗体も視野に入っているのか、、

ちょっと不思議な気がしますね。

(無題)

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No.10725-6 - 2022/08/25 (木) 00:47:32 - おお

Tandem affinity purification
でよくやられていた手法ですね。TEVプロテアーゼ切断部位をタグと目的のたんぱくの間に挿入しておいて、タグでプルダウンしたビーズをそのプロテアーゼで切断し目的のたんぱくの複合体を溶出する。

en.wikipedia.org/wiki/Tandem_affinity_purification
www.mdpi.com/1422-0067/17/3/432/htm

紹介したのはTandem affinity purificationなので２段階の精製をしてますが、そうするかどうかはあなたの実験に合わせ得て考えてください。

あとプロメガからHalo tagというのが売られていますが、このタグもTEVプロテアーゼで切断するようなデザインになってます。
www.promega.com/resources/technologies/halotag/protein-purification-from-e-coli-and-mammalian-cells/

まあ別にタグはFLAGとかでもIP後にTEVプロテアーゼで切れるようにすれば目新しいものを導入する必要もないですけどね。Invitrogen（ThermoFisher）のpCDNAシリーズにもタグが切断できるようなプロテアーゼ認識配列をいれたベクターを売ってたような気がします。

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No.10725-5 - 2022/08/24 (水) 23:45:28 - ふらいむ

タンパク質抗原で配列が既知なら、
委託でペプチド合成してもらって
免疫したほうが早くて安いかもしれません。
プランBとして参考まで。

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No.10725-4 - 2022/08/24 (水) 20:03:07 - TS

わたしもプロテアーゼ認識サイトを入れるのが手と思います。
一方で、どのタグを使われているかわかりませんが、HisとかFlagのような小さいものにしておけば、それほど影響ないのではないでしょうか。

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No.10725-3 - 2022/08/24 (水) 19:04:27 - PYK

私はpGEXなどGSTタグ付きで大腸菌で発現させ、グルタチオンビーズで落として、プレシジョンなどでGSTタグを切ってますけどね。