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(無題) 削除/引用 No.10724-24 - 2022/08/30 (火) 12:52:57 - なな zamさま 多くのアドバイスありがとうございます。 ご指摘の通り、（洗浄機がないため）一斉にwashしているので、試薬等の分注とタイムラグが生じている可能性も考えられそうです。 すぐにできる改善策として、サンプルと2次抗体の反応時間を、現在の2時間から30分〜1時間ほど延長してみようと思います。 qqさま、あのさま、時差ボケさま 貴重なアドバイスと経験談をお伝えくださり、ありがとうございます。 原因究明のためどこのステップが良くないのか、戴いた提案を試してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.10724-23 - 2022/08/27 (土) 17:25:19 - zam > 大学の研究室では洗浄機を所有しておりませんので、8連ピペットで洗浄作業をしています。 見落としていました。プレートウォッシャーでないとすると、あとはインキュベーション時間の問題でしょうか。 いずれにせよ、メーカーに問い合わせた方がよいように思います。

(無題) 削除/引用 No.10724-22 - 2022/08/27 (土) 13:00:06 - 時差ボケ 右から左、左から右に添加すれば それに準じたバイアスがかかるなら 1 6 3 4 5 2 と左右端から入れてもそれに倣うのかな 比較実験で１要素だけ変えるなんて古典的すぎるけど ELISAの各工程で 一部だけ逆順に添加してみたら どの試薬の影響か特定しやすいかも （複数工程の影響もありそうだけど） 例えば 　step1:サンプルor単品CtrL 　step2:Blocking 　step3:抗体 　step4:発色 　step5:停止 だとして 1　2　3　4　5　6 と左から入れて step4:だけ 6　5　4　3　2　1 といったふうに右から入れて 結果が　 6　5　4　3　2　1 ならば発色試薬の状態や時差の影響が強いと絞れるのでは （この書き方で伝わるかな）

(無題) 削除/引用 No.10724-21 - 2022/08/26 (金) 20:21:27 - あの 書かれた内容で、違和感を感じて、自分ならしないことは、 　　インキュベーターに入れる です。 ちなみに、濡らしたキムワイプを、密閉したジプロックにプレートと一緒に入れると、 シールもいらないし、エアコンの吹き出し口の真下でも問題無いです。

(無題) 削除/引用 No.10724-20 - 2022/08/26 (金) 12:55:12 - qq TMB発色を酸性停止して450nmで測定するのが時差が生じて難しいのであれば、TMBをできるだけ測定時間に対応するように添加して、650nmでタイムコースを取っていくのも（面倒だけど）悪くないかもしれません。 1分の時の吸光度と20分の時の吸光度の差を読めば、19分相当の吸光度になる理屈ではないかということです。

(無題) 削除/引用 No.10724-18 - 2022/08/26 (金) 12:07:59 - zam サチる前に　→　プラトーに達する前に 失礼しました。

(無題) 削除/引用 No.10724-17 - 2022/08/26 (金) 11:47:32 - zam >右から左に試薬等を添加すると、吸光度は右から左に低くなります なるほど。プレートの位置は問題ではないですね。最初に添加した列が最も高く、最後に添加した列に向かって順に低くなるということですね。 列ごとの分注ステップと96ウェル一斉洗浄ステップが混在するので、そこでラグが生じていると考えられます。 おそらく、抗原抗体反応が緩やかなのでしょう（その原因はいろいろ考えられますがここではさておきます）。 サチる前に一斉洗浄してしまっているので、先に添加した列が高く、順次低くなるのだと思います。 対策としては以下を提案します。 (1)　一斉洗浄せず、分注した列ごとに洗浄する。この場合、すべての分注間隔を揃えることに注意する。 または、 (2) サンプル（もしくは二次抗体）を添加した後の放置時間を延長する。

(無題) 削除/引用 No.10724-16 - 2022/08/26 (金) 10:35:03 - なな qqさま、みさま、G25さま、Zamさま みなさま、多くのアドバイスとご質問ありがとうございます。 質問しておきながら、十分な状況説明ができておらず、大変申し訳ございませんでした。 みなさまのご質問にまとめてお答えさせて戴きます。 > 一度同じプレートをひっくり返して測定したことがあり、ほぼ同じ結果が出ました。 結論から申しますと、反転させても最初に試薬を入れた側の吸光度が高かったです（右から左に試薬等を添加すると、吸光度は右から左に低くなります）。ですので、プレートリーダーの問題ではないと考えています。 しかし、空のプレートを測定してことはございませんので、一度測定したいと思います。 また、同じ会社のELISA kitも大なり小なり、同じような現象が生じています。 > （みさまより）Washなどのほぼ満タン滴加するステップは８連で同じチップで繰り返しても問題起こらないだろうけど、少なくとも抗体添加など厳密に添加量をそろえるべきステップは毎回チップ変えた方が良い。 ご指摘、ありがとうございます。 サンプルの添加を除いて、1枚のプレート（96well分）の試薬を添加するのに、チップを交換していませんでした。毎回チップを交換すると、1列目と12列目で時差が生じると考えていたからです。 今の現状からすると、プレートに試薬を添加する時差よりも、添加量の差で吸光度の勾配が生じている可能性が高いと考えてよいでしょうか？ > 自家調製の停止液ならば、一度作り直してみるのもよいかもしれません。 市販の1M HClを使用しています。 今まで検討した確認済みの事項について、列挙させていただきます。 �@温度管理（エアコンの風が直接当たらないようにインキュベータ内で（室温）） �A発色基質や試薬等を必ず常温にしてから使用する �B96 wellプレートのlotを変える �C以前は1wellずつ抗体（発色基質と停止液除く）を添加していたが、時差を考え、8連ピペットに変更 �D8連ピペットの種類を変更 �E同一プレートを反転させ測定（最初に試薬を入れた側の吸光度が高い） �Fプレートシールをきっちり貼る 些細な改善点は他にあると思いますが、思いつく限り列挙してみました。 お力添え戴けますと幸いです。よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.10724-15 - 2022/08/25 (木) 21:01:36 - zam > トラブルシューティングに掲載されている事象はほとんど確認したつもりなので 書くのも大変だとは思いますが、確認済みのことを書いてくださると、こちらも無駄なアドバイスをしなくて済みますし、原因を絞ることもできます。ご検討ください。 どのトラブルシューティングについても言えることですが、可能性を一つ一つ潰し、原因を絞ることが肝要です。 大別して、 ・測定系の問題 ・キットの問題 ・自家調製試薬の問題 ・手技の問題 に分けられます。 他の方々が言うように、別の装置や方法を使うことで、原因の可能性を潰していくことができます。 > 一度同じプレートをひっくり返して測定したことがあり、ほぼ同じ結果が出ました。 他の人も問うていますが、「同じ結果」の意味が二通りに解釈できるので迷います。 96ウェルプレートの12列目が高い（反転させても左側に来る列の吸光度が高い）ということか、 それとも、1列目が高い（反転させても最初に試薬を入れる側が高い）ということか。 前者ならばプレートリーダーの問題でしょうし、後者ならばキットか試薬か手技の問題でしょう。 他のELISAでも同じ現象がみられますか？それならば、そのキットの問題ではないでしょう。そのキット特有の現象ならば、メーカーに問い合わせるのが最適解だと思います。そのメーカーで既に問題を把握しているかもしれませんので。 > 停止液を添加する際、発色液と違い、チップの先端をプレートにつけないようにしていますので、停止液の方が発色液よりも多少添加スピードが速いかもしれません。 本来ならば、発色液と停止液の添加間隔は一定かつ同一であることが望ましいです。そうでないと、トピ主さんのように思わぬ結果が出たときに原因の候補が増えてしまいます。 > しかし、反応時間が20分とある中、この数秒がこれほど吸光度に影響してしまうのでしょうか？ 発色のタイムコースの結果をみないことには、その20分という反応時間がどういう性質のものかこちらでは分かりませんし、そもそもその反応系がどういうものか分かりません。ですので、20分の反応時間に対する数秒のタイムラグが影響を与えるかどうかは何とも申し上げられません。 それと関係するかどうか分かりませんが、停止液に問題があると停止時間が揃わないことがあります。 自家調製の停止液ならば、一度作り直してみるのもよいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.10724-14 - 2022/08/25 (木) 18:34:59 - G25 右から左に加えたらどうなる？　試薬を加える順番に依存するのであれば逆の勾配になるだろう（もう試してるか？）。 機械の不具合のような気がする。ブランク値が列ごとにグラディエントになっていたりしない？　（空のプレートで測ってみたらというのはそういうこと） あるいは、二波長測定ができる機械だったら、測定波長に加えて参照波長をとって標準化するとか。

(無題) 削除/引用 No.10724-13 - 2022/08/25 (木) 18:16:31 - み 蛋白を含んでいたり、界面活性剤を含んでいる溶液を同じチップで複数回吸ったり吐いたりすると、１回目より２回目、２回目より３回目と実際に採取されているボリュームは変化していくと思う。 最初の方のクリティカルなステップで添加量が違うと（左から右へ進むにつれて量的差異の勾配があると）出てくる結果はそれを反映するかもしれない。 Washなどのほぼ満タン滴加するステップは８連で同じチップで繰り返しても問題起こらないだろうけど、少なくとも抗体添加など厳密に添加量をそろえるべきステップは毎回チップ変えた方が良い。

(無題) 削除/引用 No.10724-12 - 2022/08/25 (木) 18:06:03 - qq ＞また、空のプレートを測定したことはございませんが、 コートしてある高価なプレートを使う必要はないのだから、空のプレートや同一発色したプレートを測定するべきだと思います。 ＞一度同じプレートをひっくり返して測定したことがあり、ほぼ同じ結果が出ました。 ひっくり返すとウェルの位置がずれると思ったのだけど、ちゃんと測れるんだ？ ほぼ同じ結果とは、どっちの意味なんだろう？ プレートリーダのブランクが変という意味なのでしょうか？ それとも、プレートリーダの測定には問題がないということでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.10724-10 - 2022/08/25 (木) 17:16:14 - なな ＞あのさま コメントありがとうございます。 今までプレートをスピンダウンしたことがなかったので、次回の実験で試してみようかと思います。 ＞zamさま コメントありがとうございます。 発色液（TMB）と停止液（HCl）は、同じ順番でプレートに添加していますので、停止時間をそこまで気にしていませんでした。 停止液を添加する際、発色液と違い、チップの先端をプレートにつけないようにしていますので、停止液の方が発色液よりも多少添加スピードが速いかもしれません。 しかし、反応時間が20分とある中、この数秒がこれほど吸光度に影響してしまうのでしょうか？ご教授戴けますと幸いです。

(無題) 削除/引用 No.10724-9 - 2022/08/25 (木) 16:45:09 - zam >[Re:1] はなさんは書きました : > 違和感とは、抗体や発色基質等の試薬やサンプルは時間差がないように、8連ピペットでプレートの左から右に（30秒以内に）添加しているのですが、吸光度が左から右へと低くなってしまいます（一番左端の列が最も吸光度が高い）。 単純に考えて、反応停止時間（発色停止時間）が揃っていないように思います。 反応停止液（発色停止液）に問題があるではありませんか？

(無題) 削除/引用 No.10724-8 - 2022/08/25 (木) 15:25:30 - あの 記載内容だけからはよく判りませんが、できれば要所要所で、マイクロプレート遠心機でスピンダウンする方が、データのばらつきは小さくなります。

(無題) 削除/引用 No.10724-7 - 2022/08/25 (木) 15:24:34 - なな ＞LPSさま ご指摘ありがとうございます。 発色試薬（TMB）は、添加の約3時間前より室温に出しています。 その他のBuffer等につきましても、すべて室温のものを使用しています。

(無題) 削除/引用 No.10724-6 - 2022/08/25 (木) 11:15:28 - LPS 最後の発色試薬は室温に戻してから使ってますか？使う直前に冷蔵庫から出したりしてませんよね

(無題) 削除/引用 No.10724-5 - 2022/08/25 (木) 09:48:32 - なな みなさま、早速のご回答ありがとうございます。 大学の研究室では洗浄機を所有しておりませんので、8連ピペットで洗浄作業をしています。 プレートリーダーは2年に1度校正しており、他の研究員も使用していますが、異常だと報告を受けていませんので、問題ないかと考えています。 また、空のプレートを測定したことはございませんが、一度同じプレートをひっくり返して測定したことがあり、ほぼ同じ結果が出ました。 トラブルシューティングに掲載されている事象はほとんど確認したつもりなので、本当に困っています…。

(無題) 削除/引用 No.10724-4 - 2022/08/24 (水) 22:02:15 - LPS 同じプレートを180度ひっくり返して読んでも同じ結果が出ますか

(無題) 削除/引用 No.10724-3 - 2022/08/24 (水) 21:05:22 - ww プレートリーダーに異常はないことは確認ずみですか？ 空のプレートまたは発色試薬を均一で分注して測ってみては。 それで値が異なるなら測定位置がちょっとずつずれてしまっているとか。

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