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(無題) 削除/引用 No.10718-17 - 2022/09/07 (水) 10:54:30 - acd >ブロッキングというよりはコーティング補助ですよね、親和性を上げるための。 すいませんが、理解が追い付いていません。 例えば、fibronectinでdishコートしたとして、その後実験に使用する時に、培地にBSAや何やらを加えたら、接着効率が高まるということでしょうか？ 自分のイメージでは、BSAを加えるとと、fibronectinとBSAが競合する形になって、細胞が接着しないイメージがあったのですが、これが間違っているということでしょうか？ あるいは、dishをfibronectin等でコートする時にBSAを加えるとコーティングの効率が高まるということでしょうか？ 書いていただいた文章が難しくて理解できていないです。

(無題) 削除/引用 No.10718-16 - 2022/09/05 (月) 05:43:11 - おお >[Re:15] たこさんは書きました : > 的外れかもしれませんが > > ・あのさんの仰るように、プレートの可能性は十分ありますので検討するのが良いと思います。これも経験がありますので・・・ > あと、ブロッキングをBSAでなく、ゼラチン、カゼインなんかを使って接着を見ている人もいました。結構劇的に結果が変わっていた記憶があります。 ブロッキングというよりはコーティング補助ですよね、親和性を上げるための。ゼラチンはコラーゲン由来だからそういうマトリクスに結合するときに起こる生理的な反応が気になる。だから最初の方にポリリジンなどを提案したのだけど。たんぱくに覆われてない細胞は負電荷を帯びているので、そういう細胞が吸着するようになる。逆にTCように処理されたDishは負の電荷を帯びていて、細胞が出すマトリクス成分が負電荷を帯びた細胞に結合するための陽電荷を帯びた部分を利用して細胞を吸着させる。

(無題) 削除/引用 No.10718-15 - 2022/09/05 (月) 01:33:03 - たこ 的外れかもしれませんが ・あのさんの仰るように、プレートの可能性は十分ありますので検討するのが良いと思います。これも経験がありますので・・・ あと、ブロッキングをBSAでなく、ゼラチン、カゼインなんかを使って接着を見ている人もいました。結構劇的に結果が変わっていた記憶があります。 ・Coating効率ももちろん気になるところですが、その接着分子のタンパク質活性が生きているかどうかも気になります。購入品の場合活性が落ちていたりする場合もあるのでちょっと注意する必要があるように思います。 本来であれば何かしら評価する系(例えば接着するとすでに分かっている細胞を使ってattachment assay)があればそれを確認したいところです。 そこをすっ飛ばして非常に痛い目にあったので・・・ ・いまさらですが、単純に接着活性が低い分子という可能性はないでしょうか？ あるいはreceptor自体の発現が十分あるのかとか。 接着分子のcoatingに使用する濃度は十分と考えてもいいですよね。 興味のある実験ですので色々と条件等を聞きたいところもありますが、ひとまず失礼します。

(無題) 削除/引用 No.10718-14 - 2022/08/27 (土) 21:09:44 - acd >細胞表面にたんぱくを介してつくということでしたら、培地に入れて細胞の変化を見るということも可能かと思いますが（サイトカインとか増殖因子とか大抵そうですよね）。そちらの方が確実に濃度を調整できるので。やってみたけどイマイチだったということでしょうかね。 背景を話すと複雑ですが、基本的には差がなかったと解釈しています。 ＞ブロッキング。　もしかしたらBSAとかより、合成物系が良いかも。 接着が見られない段階で、ブロッキングは必要でしょうか？例えばファイブロネクチンのdishはあまりブロッキングしないイメージがありますが、、、 ＞結合した後に増殖できる、元は浮遊細胞。　既発表論文等の根拠ありますか？ 少なくともファイブロネクチンのdishを使うと、結合して、増殖することは自分で確認しています。問題は今回解析しているタンパク質を結合させたdishです。 紹介していただいたcovalentのdishいいかもしれないですね。試してみます。どれくらいのタンパク質がくっついているかが非常に重要そうです。

(無題) 削除/引用 No.10718-13 - 2022/08/26 (金) 06:47:42 - あの 面白そうなテーマですね。 二つ疑問があります。 ブロッキング。 　もしかしたらBSAとかより、合成物系が良いかも。 結合した後に増殖できる、元は浮遊細胞。　 　　既発表論文等の根拠ありますか？

(無題) 削除/引用 No.10718-12 - 2022/08/26 (金) 02:31:16 - おお 細胞表面にたんぱくを介してつくということでしたら、培地に入れて細胞の変化を見るということも可能かと思いますが（サイトカインとか増殖因子とか大抵そうですよね）。そちらの方が確実に濃度を調整できるので。やってみたけどイマイチだったということでしょうかね。

(無題) 削除/引用 No.10718-11 - 2022/08/26 (金) 01:41:36 - おお 確実に吸着させたいなら、コバレントに保持してくれるようなものを使えばどうでしょうか。以下のようなものとか。 https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/protein-biology/protein-assays-analysis/elisa/elisa-microplates-plasticware/covalent-crosslinking-immunoassay-plates.html

(無題) 削除/引用 No.10718-10 - 2022/08/25 (木) 22:21:08 - LPS Elisaを提案したのは、最初の質問でプレートがコートされているか、確信が無いような質問に思えたからです。実験で想定される条件で、コートしたタンパク質がちゃんとプレートに保持されているか確認してはどうかと思ったので

(無題) 削除/引用 No.10718-9 - 2022/08/25 (木) 18:42:16 - acd >もう少し　情報が欲しいですね。 それは細胞外タンパクで、細胞には受容体がある？ 受容体という言い方が正しいか分かりませんが、結合パートナーです。 ＞細胞が接着するかどうかだけで、そのタンパクの有無の違いを見出そうとしている？ だけ、というわけではないのですが、単純にそのタンパク質の有無が結合に非常に重要だということを示したいと考えています。ファイブロネクチンには結合することは分かっているので、ダブルコーティングして、結合する細胞の比率を比較するということも可能でしょうか？調べようと思いますが、御存じの方いますか？ ＞何らかのコートが無いと、その細胞は接着しにくい、それとも、接着しやすい？ そのタンパク質でコートすると、そのタンパク質を認識して、浮遊性細胞が付着すると考えています。 ＞秘密なら仕方ありませんが、どちらも接着したのか、どちらも接着しないのかで考慮すべき点が違ってきますでしょうに。 上記で挙げましたが、浮遊性細胞が付着すると予想しています。ただ過去に論文がないので、本当にそれが起こるかはまだ分かりません。 ＞その接着分子に対する抗体があるならELISAをやってみたらと思います。 洗浄後、培地でインキュベーション後の洗浄後、などの条件で。 なるほど逆の考え方ですね。これは価値がある提案ですね。検討したいと思います。一方で、この研究は浮遊性細胞が付着すると細胞の特殊な形態変化が起こるということも想定しています。それを証明するには、何らかの足場が必要で、それはELISAだけでは証明できないですね。

(無題) 削除/引用 No.10718-8 - 2022/08/23 (火) 08:32:39 - 774R >細胞の接着具合がcoatedとuncoatedで全く変わりありません。 どう変わりがないのか具体的に書くことは出来ない事情でもあるのでしょうか？ 秘密なら仕方ありませんが、どちらも接着したのか、どちらも接着しないのかで考慮すべき点が違ってきますでしょうに。

(無題) 削除/引用 No.10718-7 - 2022/08/23 (火) 02:56:51 - あの もう少し　情報が欲しいですね。 それは細胞外タンパクで、細胞には受容体がある？ 細胞が接着するかどうかだけで、そのタンパクの有無の違いを見出そうとしている？ 何らかのコートが無いと、その細胞は接着しにくい、それとも、接着しやすい？

(無題) 削除/引用 No.10718-6 - 2022/08/23 (火) 02:14:34 - LPS その接着分子に対する抗体があるならELISAをやってみたらと思います。 洗浄後、培地でインキュベーション後の洗浄後、などの条件で。

(無題) 削除/引用 No.10718-5 - 2022/08/22 (月) 19:54:59 - あの ヌンクだったと思うけど、プラスチックの素材の違いで、チャージ具合が ポジティブ、ニュートラル、ネガティブの違うのを揃えているので、 試供品もらって比較してみたらどうでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.10718-4 - 2022/08/22 (月) 15:33:39 - おお >[Re:1] acdさんは書きました : > とある接着分子のタンパク質coated dishの作成を行っているのですが、細胞の接着具合がcoatedとuncoatedで全く変わりありません。 接着具合で判別できるのでしょうか。そらコラーゲンみたいなものだったろ見れるかもしれないけど。BSAをコートした場合をかんがえると、、、 グーグルで検索したりするとブラッドフォードプロテインアッセイ試薬で発色するか見たらいいという話もある。底の部分が青みがかるのだろうけど。そういう意味ではBCAでもいいかなと思わなくもない。ただ検出感度以下のコートで十分なら意味がない。ならば、銀染色やってみる？ あとは、ポリリジンとかと混ぜて巻き込ませるように吸着させるとか。いずれにしてもどれくらい吸着したかは調べないとわからないのだろうけど。ポリリジンとか使った場合はブロッキングして抗体をいれてELISAのようなことせざる負えないかなぁ。

(無題) 削除/引用 No.10718-3 - 2022/08/22 (月) 14:36:48 - 散々 タンパク質がコートされたかどうかなんて、水を弾くか、濡れるかを 観ていたら、一目瞭然でしょう。 一晩なんて言わずに、数分の出来事。 >[Re:2] G25さんは書きました : > 昔はわざわざ炭酸バッファーでpHを上げた溶液をつかったりしていました。 炭酸バッファー、使われていましたねぇ。 この迷信は何処起源なんでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.10718-2 - 2022/08/22 (月) 10:49:41 - G25 今はPBSなどでもコーティングの効果は変わらないというのが一般的な認識だと思いますが、昔はわざわざ炭酸バッファーでpHを上げた溶液をつかったりしていました。たぶん、タンパク質や器材のポリスチレンの電荷の関係からそう考えられていたんだと思います。 それに習って、pHを上げる（場合によっては下げる）とか試してみては。 ところで、そのタンパク質の等電点とかサイズとか、どんなもんでしょうか。極端だったりしますか。

coated dishの作成方法 削除/引用 No.10718-1 - 2022/08/22 (月) 09:18:35 - acd とある接着分子のタンパク質coated dishの作成を行っているのですが、細胞の接着具合がcoatedとuncoatedで全く変わりありません。 他のたんぱく質と同様に、PBSに溶解したタンパク質でovernight incubationしているのですが、これだけではタンパク質が付着しないのでしょうか。過去にこのタンパク質でcoatした例は報告されていません。 何か工夫できることはありますでしょうか。

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