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(無題) 削除/引用 No.10715-5 - 2022/08/21 (日) 08:35:02 - おお >[Re:4] Hydeさんは書きました : > ありがとうございます。 > それではPCRと電気泳動だけでは、シングルセルを確定困難ですね。 > 確実にシングルセルを拾うならば、やはり顕微鏡でみながら、ろ紙で確実にシングルのコロニーを確認しながら拾うのがよさそうですかね。 https://j-toho-kk.co.jp/product_categories/%E3%82%AF%E3%83%AD%E3%83%BC%E3%83%8B%E3%83%B3%E3%82%B0%E3%82%B7%E3%83%AA%E3%83%B3%E3%83%80%E3%83%BC/ クローニングシリンダーというものがあります。構造は単純なので自分で作れるならそれでもいいでしょう。 その他限界希釈というか９６ウェルとかに（更にちっちゃくてもいいと思いますが）、細胞が一個だけ入ったことを顕微鏡で確認してそういうウェルから細胞を回収することもあります。 > > また個人的考えですが、仮に少々WTの細胞が混ざったとしても、ノックインした蛋白の発現が途中で少なくなった時に適宜抗生剤で再度セレクションして、WTを適宜除けば、問題内容ないようにも思いますが、いかがでしょうか。。 ノックインに薬剤耐性マーカーが入っていたら可能です。というか最初から混ざらないように薬剤を入れとけばいいだけの話だと思いますが。まあたまにノックインしたものが細胞にあまり良い影響がなく欠失してしまうっていうのはあり得るかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.10715-4 - 2022/08/20 (土) 18:18:30 - Hyde ありがとうございます。 それではPCRと電気泳動だけでは、シングルセルを確定困難ですね。 確実にシングルセルを拾うならば、やはり顕微鏡でみながら、ろ紙で確実にシングルのコロニーを確認しながら拾うのがよさそうですかね。 また個人的考えですが、仮に少々WTの細胞が混ざったとしても、ノックインした蛋白の発現が途中で少なくなった時に適宜抗生剤で再度セレクションして、WTを適宜除けば、問題内容ないようにも思いますが、いかがでしょうか。。

(無題) 削除/引用 No.10715-3 - 2022/08/20 (土) 07:02:17 - おお >ＦＲと同じ明るさのバンドがＦＳまたはＳＲにあれば,single cellと言えると思います。 理想的にはそうだけど、微妙に増幅効率が違ったりとかで同じ明るさにならないこともまあまああります。また電気泳動で見るのであれば、PCRによる増幅は途中で飽和状態になりプラトーに達してしまい理想的な増幅がされているところで電気泳動で検出するのが難しいので１：２の割合でも同じぐらいに見えてしまう可能性もある（そういうことだからqPCRはリアルタイむで検出するようになっている）。 なので染色体2本であってもシングルセルであることが排除できないなら、両者のバンドの割合が一緒に見えてもシングルセルからのクローンだと判断できない。また、まれに両アレルにノックインができて、それにノックインが全くされてない細胞が混じっている可能性を否定するなら、やはり確実にシングルで拾うしかなかろう。

(無題) 削除/引用 No.10715-2 - 2022/08/20 (土) 01:45:35 - おお シングルの細胞を単離するときに、確実にシングルと言えるようにすればいい話では？

HEK293Tのsingle cellの選定の方法 削除/引用 No.10715-1 - 2022/08/19 (金) 23:29:40 - Hyde HEK293TのAVVS1 T2にCRISPER/Cas9で遺伝子をノックインし、single cellを作成している所です。しかしHEK293Tは19番染色は3本であることが多く、加えて継代しているうちに染色体がかわることもある様です。 染色体2本の細胞ならば、AVVS1 T2の両サイドでプライマーF,Rを作成し、ノックインする遺伝子内にプライマーSを設定し、ＦＲ，ＦＳ，ＳＲでＰＣＲすれば、ＦＲと同じ明るさのバンドがＦＳまたはＳＲにあれば,single cellと言えると思います。 しかし染色体3本以上ある場合は、3本染色体の内に1本に変異入ってもとバンドの明るさは同様にならないので、wild typeの細胞が混ざっていることを除外できません。 良い解決法はありますでしょうか。

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