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(無題) 削除/引用 No.10714-9 - 2022/08/18 (木) 10:52:32 - G25 >例えばゲルを溶かすときの温度コントロールは何度でどのような装置でやっているか？ というのも、以前、うっかり少々温度高めのウォーターバスでやったら、精製したDNAの泳動像がおかしかったことがあったので。

(無題) 削除/引用 No.10714-8 - 2022/08/18 (木) 10:47:24 - G25 泳動像がスメアになる可能性としては、 ・特に短い断片の場合、シリカマトリックス上で二本鎖が解離することがあり、この場合、溶出液を泳動するとボケたスポットになる。キアゲンのマニュアルのトラブルシュートなんかにも出ています。 ・泳動サンプルが十分バッファーされていない。溶出液は薄いバッファーあるいは純水です。ローディングダイにはバッファーが入っていないのが普通です。例えば1 uLの溶出液を水で10 uLボリューム調整してローディングダイを入れたりすると、 弱塩基性にバッファーされないためDNAの移動度がおかしくなって、ボケたり複数バンドになったりします。水ではなくTEなどを使うべき。 普段、PCR産物や制限酵素消化物をそのまま泳動するときなんかは、反応バッファーでバッファーされるので、あまり意識されていないかもしれないけど。 >通常あえて流すことはしないと思うけど 私はルーチンで泳動してチェックします。精製度の定性的なチェック（他のDNA断片やプライマーダイマー等が混入していないか、変性していないか）と定量的なチェックのため（バンドの染色強度の比色でestimate。nanodropなんかがなくても微量の定量ができるし、吸光度ではしばしばあるような、干渉物質によってとんでもない外れ値がでたりしない）。

(無題) 削除/引用 No.10714-6 - 2022/08/18 (木) 08:51:45 - TS ゲル精製前にバンドがきれいなのに、精製後にもう一度流すとスメアになって終了も低いということですか（通常あえて流すことはしないと思うけど）。 他の方もおっしゃるように状況がわかりにくいですね。 わたしはMNを使ってますが特に問題ないです。 PCRしてゲル抽出なら、10-20 ng/µLは低くないと思います。 スメアになるのはなんでしょう？　UVの当てすぎとかで起こるかなぁ。 MNとQiagenの2つのキットを使って同じトラブルが起こるというのは、 なにか基本的な部分がおかしいような気がします。

(無題) 削除/引用 No.10714-5 - 2022/08/17 (水) 17:34:37 - おお https://international.neb.com/-/media/nebus/files/brochures/monarch_brochure.pdf?rev=0e6c18a67c79463b9b4d1fb27adad72d&hash=04EB2734366192914F06C00EF4477014 ここのp１７。1ugを流してQiagenで精製すると、収率７０から８０％で濃度は２５ng/ul。それを考えると、ゲルで流した量がそれ以下の可能性を考慮するとそんなに変な数字でもなさそう。 NEBの商品は溶出のバッファーをQiagenの５分の１ぐらいに減らしても溶出可能らしく高濃度で溶出できるらしい。収量はそんなにQiagenとかわらない。 https://international.neb.com/products/t1020-monarch-dna-gel-extraction-kit#Product%20Information それでも収量が上る可能性を追求したいならエリューションを半量で二回に分けるとか、エリューションの水をカラムに乗せて遠心しないで数分おいてみるとか、それなりの工夫はあることはある。今はあまり関係ないかもしれないけど、むかしは泳動バッファーはTBEよりTAEのほうがこういったたぐいの精製方法で相性がいいという話もあったような。 PCR産物なのか、ベクターから切り出したものなのかでもスメアーの原因の判断がばらけるかも。

(無題) 削除/引用 No.10714-4 - 2022/08/17 (水) 17:02:14 - G25 追伸、 バンドがスメアになるというけれど、どのようにサンプル調製して泳動しているか、

(無題) 削除/引用 No.10714-3 - 2022/08/17 (水) 17:00:23 - G25 >バンドがくっきりしかもスメアってるうえに、 よくわかりません。 バンドがくっきりしていると同時にスメアになっているという、なんだか矛盾したことを言っているようにとれる。 >プロトコール通りにやっても収量がng/ulで10とか20、あるいは一桁の時もあります。 収量とは取得された総量で表すべきで、濃度ではわかりません（総体積でも示されなければ）。また、元あった量に対して取れた量がどれくらいなのか、収率がどれほど低いのかも見当つかない。 加えて欲しい情報は、 低収量なのはDNAのサイズなどの条件が違ってもいつもなのか、 プロトコール通りにやっていると言ってもどの程度忠実にやっているかはわからないのですよね。例えばゲルを溶かすときの温度コントロールは何度でどのような装置でやっているか？　溶出は付属の溶出バッファーか自前のバッファーあるいは純水などか？

(無題) 削除/引用 No.10714-2 - 2022/08/17 (水) 16:56:54 - おお >[Re:1] ゲルCHUさんは書きました : > 電気泳動のバンドを含むゲルから遺伝子断片を抽出する市販のキット、MNのとQIAGENのを使ってみましたが、バンドがくっきりしかもスメアってるうえに、プロトコール通りにやっても収量がng/ulで10とか20、あるいは一桁の時もあります。 > 10ng/ulぐらいで、ボリュームが５０ul なら、０．５ug取れたことになる。普段の検出と同じように流して切り出ししてるならそれぐらいでもおかしくないような気がする、１レーン１ugも流したらサイズによるかもしれないけど流れ方が乱れてもおかしくないくらいだし。

ゲル抽出の終了 削除/引用 No.10714-1 - 2022/08/17 (水) 15:24:15 - ゲルCHU 電気泳動のバンドを含むゲルから遺伝子断片を抽出する市販のキット、MNのとQIAGENのを使ってみましたが、バンドがくっきりしかもスメアってるうえに、プロトコール通りにやっても収量がng/ulで10とか20、あるいは一桁の時もあります。 収量を上げるこつとか他のキットはありますか？

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