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(無題) 削除/引用 No.10705-5 - 2022/08/15 (月) 20:47:15 - LPS 早速のお返事ありがとうございます。とても参考になりました。

(無題) 削除/引用 No.10705-4 - 2022/08/15 (月) 11:45:59 - おお >[Re:1] Kさんは書きました : > > ウイルスベクターがきちんと出来ているかは、HEK293TやNIH3T3へ感染させて5割以上がdsRed陽性細胞になることは確認できています。またこの時、Creをウエスタンで検出可能です。 > それらの細胞で入っていない細胞が目立つようなら、ウイルスのタイターが低すぎると思います。

(無題) 削除/引用 No.10705-3 - 2022/08/15 (月) 10:59:31 - EC LPS様、 大動脈内皮細胞は1匹のマウスから得ています。 心臓直後の大動脈を2-3cmをアダルトマウスから得て、それをdispase処理したものをcollagenIVコート6 cm dish 1枚に播種するのみです。1週間もすればコンフレントになります。パッセージは3回ほど可能です。 CD31のフロー解析により内皮細胞を確認しています。

(無題) 削除/引用 No.10705-2 - 2022/08/15 (月) 07:01:57 - LPS 質問の主旨とは違いますが、大動脈血管内皮細胞はどうやって単離されましたか。何匹のマウスから始めて、どれくらいの細胞が取れていますか？ 宜しければ教えて下さい。

マウスプライマリ細胞への遺伝子導入 削除/引用 No.10705-1 - 2022/08/15 (月) 02:51:27 - K いつも拝見させていただいております。 私はある遺伝子のfloxedマウスを作製いたしました。 Creマウスはまだ手元にないため、インビトロでCreによるrecombinationを確認できればと考えています。 Creはレンチウイルスベクターを自家調製しました。 細胞は、floxedマウスから得たプライマリ細胞ですが、 1. 骨髄をフラッシュして、それを培養したヘテロな接着細胞 2. 大動脈から血管内皮を単離して培養したもの 3. 肺をDispase処理して得た接着細胞 以上3種類の細胞ソースにレンチウイルスを感染させました。 感染するとdsRedが発現し、IRES下でCreが発現するベクターを使用しています。 今、直面している問題は、dsRed陽性の細胞が全く得られないということです。 ウイルスベクターがきちんと出来ているかは、HEK293TやNIH3T3へ感染させて5割以上がdsRed陽性細胞になることは確認できています。またこの時、Creをウエスタンで検出可能です。 論文を調べると、Creをインビトロで発現させる際はAAVを使ってることが多いです。 だとするとプライマリ細胞へはレンチウイルスは感染しにくいということになるでしょうか？ psPAX2とpMD2.Gを使ってVSV-G pheudo-typed lentivirusを使っています。 プライマリ細胞へのレンチの感染が全く見られず困っています。 どんな些細なことでも構いませんので、アドバイスをいただけましたら幸甚です。 どうか、よろしくお願いいたします。

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