Bio Technical フォーラム

  • バイオ関連の実験をする上での、試薬、機器、プロトコールなどの情報交換の場です。
  • 新しいテーマで話を始める場合、質問をする場合は「新しいトピックを作る」から書き込みをしてください。
  • 質問に対して解答できる方は是非、書き込んで下さい。
  • このフォーラムにふさわしくないと管理人が判断した投稿は予告なく削除します。

新しいトピックを作る　|　トピック一覧　|　研究留学ネットに戻る

ひとつ前のフォーラム（readのみ）

このスレッドをはてなブックマークに追加このスレッドをはてなブックマークに追加

In Fusion Cloningがうまくいきません トピック削除
No.10702-TOPIC - 2022/08/10 (水) 18:31:37 - ozaki
In Fusion Cloningがうまくいきません。
vecter（8,000bp）をInverse PCRによってOpenし、Insert（80bp）をアニーリングで合成したものをIn Fusion Cloningしています。
しかしながら、コロニーが一切生えません。
VectorとInsertは電気泳動によりサイズを確認し、それぞれ切り出しをしています。
何か原因考察できますでしょうか？
ちなみにIn Fusionの試薬は正常である事をpUC19で確認しています。

[Inverse PCR]
KOD One 25ul
Plasmid (200ng/ul) 1ul
Fwd Primer (10uM) 1ul
Rev Primer (10uM) 1ul
H2O 22uL
Total 50ul
Takara PCR TP600 (program : Inverse PCR)
98℃ 1min
98℃ 10sec
55℃ 5sec
68℃ 1min
68℃ 1min
12℃ ∞

[Annealing]
Primer1 (100uM) 25ul
Primer2 (100uM) 25ul
4xAnnealing buffer 25ul
H2O 25ul
Total 100ul
PCR機 (Annealingというprogram作成済、Takara TP600)
95℃　10min
30℃　slope 60min
29℃　2min
28℃　2min
27℃　2min
26℃　2min
25℃　5min
4℃ 　∞
　
- このトピックにメッセージを投稿する -



全5件 ( 1 〜 5 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用
No.10702-5 - 2022/08/11 (木) 06:51:46 - 774R
Inverse PCR産物のセルフライゲーションをInFusionする奴ですね。
私もよくやります。本件のように配列を付加する場合も、デリーションする時も非常に効率が良く、成功率も高いですね。もう、プライマーをリン酸化して平滑末端のライゲーションとか、制限酵素サイトを工夫して入れてとかやらなくなりました。

(無題) 削除/引用
No.10702-4 - 2022/08/10 (水) 22:47:01 - toto
single strandのDNAが反応を邪魔してると思います。それで、zamさんの書かれたようなPCRのほうがうまく行きます。ただ、anealしたオリゴをゲル精製すればいいはずです。

(無題) 削除/引用
No.10702-3 - 2022/08/10 (水) 21:48:48 - zam
追伸。
インサートはPCR産物ではなく、アニーリングしたオリゴですね。失礼しました。
それとは異なるやり方として、たとえばvectorの末端とアニールする20mer程度+付加したい配列の半分（40merほど）からなるforward primerと、vectorのもう一つの末端とアニールする20mer程度+付加したい配列の残り半分（40merほど）からなるreverse primer、これらprimerの両末端15merが相同となるようにデザインする。
この長いprimerセットでvectorにinverse PCRを掛け、できたPCR産物でin-fusionを行うという方法もあります。
この方法に名前が付いているかどうか存じませんが、私がよくやる方法です。

(無題) 削除/引用
No.10702-2 - 2022/08/10 (水) 21:30:30 - zam
> ちなみにIn Fusionの試薬は正常である事をpUC19で確認しています。

ポジコン（control insert +linearized pUC19 vector）のIn-fusion処理後にStellarをトランスフォーメーションしてコロニーが生えたということですね？

であれば、主に原因として考えられること、およびその対処は以下の通りだと思います。

1. PCR primerのデザインが間違っている
→配列の確認。

2. 切り出しの際にDNAがUVダメージを受けている
→PCR反応液を切り出さずにそのままIn-fusion処理をする（cloning enhancer処理→In-fusion処理）、またはスピンカラム精製したDNAかエタ沈したDNAをIn-fusionに供する。

3. インサート：ベクターのモル比が不適当
→80bpのインサートの場合、インサート：ベクターのモル比は10：1ぐらいでどうでしょうか（詳しくはUser Manualをお読みください）。

実験の単純なミスを除けば、とりあえずこんなところでしょうか。

In Fusion Cloningがうまくいきません 削除/引用
No.10702-1 - 2022/08/10 (水) 18:31:37 - ozaki
In Fusion Cloningがうまくいきません。
vecter（8,000bp）をInverse PCRによってOpenし、Insert（80bp）をアニーリングで合成したものをIn Fusion Cloningしています。
しかしながら、コロニーが一切生えません。
VectorとInsertは電気泳動によりサイズを確認し、それぞれ切り出しをしています。
何か原因考察できますでしょうか？
ちなみにIn Fusionの試薬は正常である事をpUC19で確認しています。

[Inverse PCR]
KOD One 25ul
Plasmid (200ng/ul) 1ul
Fwd Primer (10uM) 1ul
Rev Primer (10uM) 1ul
H2O 22uL
Total 50ul
Takara PCR TP600 (program : Inverse PCR)
98℃ 1min
98℃ 10sec
55℃ 5sec
68℃ 1min
68℃ 1min
12℃ ∞

[Annealing]
Primer1 (100uM) 25ul
Primer2 (100uM) 25ul
4xAnnealing buffer 25ul
H2O 25ul
Total 100ul
PCR機 (Annealingというprogram作成済、Takara TP600)
95℃　10min
30℃　slope 60min
29℃　2min
28℃　2min
27℃　2min
26℃　2min
25℃　5min
4℃ 　∞
全5件 ( 1 〜 5 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する
名前 
メール  　アドレス非公開
   タイトル 
本文      
設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます）
上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません）
解決（問題が解決した際にチェックしてください）
暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。
送信 
〔使い方〕
  • 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。
  • 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。
  • 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。