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(無題) 削除/引用 No.10699-13 - 2022/08/12 (金) 09:10:53 - 774R ずいぶん昔のことを思い出しました。 内在性にCm耐性プラスミドを持つ菌にAmp耐性のプラスミドをトランスフォームしようとしたときに、全くコロニーが増えないことがありました。 このトピと同様にAmpのみのプレート、Cmのみのプレートでは育つことを確認し、結局Cmの濃度を下げることで解決した覚えがあります。 単剤では育つけれども、2剤併用による相乗効果があったのではないかと考えています。 それから、とある目的のために自分でデザインした内在性プラスミドを入れるために、元々入っていた内在性プラスミドを脱落させようとしたことがあります。選択薬剤なしで液体培養を続けてから、シングルコロニーを作らせて、落としたいプラスミドの薬剤に感受性が出たことを指標として選択しましたが、1日やそこらでは全くそのようなコロニーが得られず、1週間くらい継代する必要がありました。

(無題) 削除/引用 No.10699-12 - 2022/08/12 (金) 07:40:11 - momo プラスミドの脱落というのは文字通りの意味ではなく、細胞分裂に際して分配されなかった細胞が増えるということですから、１時間やそこらの回復培養中に薬剤耐性コロニーが出なくなるほどプラスミドが脱落するということは起こり得ないでしょう。

(無題) 削除/引用 No.10699-11 - 2022/08/11 (木) 12:34:04 - zam 念のため補足します。 クロラムフェニコールはタンパク質合成阻害剤ですから、宿主大腸菌内にCamRの遺伝子産物CAT（chloramphenicol acetyltransferase）が一定程度存在しないと宿主は増殖できません。 そのため、JM109のようにCamRを持たない大腸菌を宿主とし、目的遺伝子及びCamRを持つベクターで形質転換体を得たい場合には、クロラムフェニコールで選択圧をかけるわけですが、上述の理由により、まずはクロラムフェニコール不含培地で一定時間培養し、CATを宿主内でタンパク合成させておく必要があります。この培養のことを「回復培養」と呼ぶこともあるようです（私はこの語は使いませんが……）。 一方、トピ主さんのように、Rosetta(DE3)を宿主として使う場合には、クロラムフェニコール含有培地で培養したRosetta(DE3)をHanahan法か何かで作られたコンピテントセルを調製するのでしょうから、その宿主内にはpRAREが保持されておりCATも一定程度存在しているはずです。 したがって、そうして作られたコンピテントセルを使う際に、わざわざクロラムフェニコール不含培地で培養する必要がありません。いやむしろ、クロラムフェニコール非存在下で培養してしまうせいで、pRAREの無い大腸菌が増えてしまいかねません。 ……皆さんがコメントしているのはそういうことです。 次に、自分の目的遺伝子を有するベクターで、そのコンピテントセルRosetta(DE3)を形質転換させたい場合についてです。 ここで何を選択圧に使用するかによって異なります。 カナマイシンを使う場合は、これもタンパク質合成阻害剤なので、カナマイシン不含培地（ただしクロラムフェニコールは必要）で「回復培養」をする必要があります。私の経験上15分間の培養で大丈夫です。 アンピシリンを使う場合は、これはタンパク質合成阻害剤ではないので、「回復培養」のステップはなくても大丈夫です。詳しくは生化学か微生物学などの教科書をお読みください。

(無題) 削除/引用 No.10699-10 - 2022/08/11 (木) 12:18:01 - zam > そのようでしたら、回復培養時における脱落を防ぐためにどのようにしたらよいのでしょうか。 もし「回復培養」が必要ならば、クロラムフェニコール存在下で「回復培養」を行えばよろしいのではないでしょうか。 そもそもアンピシリンで選択圧を掛けたい場合は、アンピシリン無しの「回復培養」というステップはなくても大丈夫です。

(無題) 削除/引用 No.10699-9 - 2022/08/11 (木) 11:00:36 - おお >[Re:8] あつしさんは書きました : > > 回復培養時に更に目的の遺伝子を脱落させている可能性さえあるのではないですか。 > > ここでいう目的遺伝子とは、自分で構築したベクター上の遺伝子のことでしょうか?そのようでしたら、回復培養時における脱落を防ぐためにどのようにしたらよいのでしょうか。 違います pRARE (CamR)が抜けているという一連の流れの中で書いてますが、、、

(無題) 削除/引用 No.10699-8 - 2022/08/11 (木) 10:48:53 - あつし > 回復培養時に更に目的の遺伝子を脱落させている可能性さえあるのではないですか。 ここでいう目的遺伝子とは、自分で構築したベクター上の遺伝子のことでしょうか?そのようでしたら、回復培養時における脱落を防ぐためにどのようにしたらよいのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.10699-7 - 2022/08/10 (水) 23:08:23 - おお >[Re:5] あつしさんは書きました : > > ストックのコンピテントセルから、抗生物質を含む寒天培地に播く際は、SOB培地による回復培養は必要でしょうか。クロラムフェニコールのような抗生物質を使用する場合は必要な気がしますが...。いかがでしょうか。よろしくお願いいたします。 薬剤耐性の遺伝子を持った菌は新たにその遺伝子が導入されたわけでもないので、すでに機能していて、遺伝子産物も菌内に存在するわけだから、新たに導入された遺伝子発現を待つような回復培養は理屈にあっていません。 回復培養時に更に目的の遺伝子を脱落させている可能性さえあるのではないですか。

(無題) 削除/引用 No.10699-6 - 2022/08/10 (水) 20:44:02 - G25 直感的にも経験上も必要ないと思います。 凍らされているのはプラスミド導入直後の細胞ではなく、十分に培養された後のもので、プラスミドののコピー数も最大限に増え、薬剤耐性遺伝子産物も十分に蓄積された状態でしょうから。

(無題) 削除/引用 No.10699-5 - 2022/08/10 (水) 19:27:09 - あつし zam様、m様、G25様、回答ありがとうございます。 > 継代には抗生剤入りプレート ストックのコンピテントセルから、抗生物質を含む寒天培地に播く際は、SOB培地による回復培養は必要でしょうか。クロラムフェニコールのような抗生物質を使用する場合は必要な気がしますが...。いかがでしょうか。よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.10699-4 - 2022/08/10 (水) 09:14:51 - G25 もともと宿主が保持しているプラスミドがあり、薬剤耐性マーカーがある場合、選択薬剤存在下で培養すべきですね。 少なくとも、ストックから選択培地にstreakして取ったシングルコロニーから始めるべきで、コンピーテントセルからの植え継ぎでプレパレーションするのはやめたほうがいい。もちろん、液体培養で殖やすときにも選択薬剤を入れない理由はないはずです（入れろと明記されていないプロトコールもあるようですが）。 なお、JM109もF'因子を持っていて青白選択やF線毛に必要な因子が乗っているので、落とさないように留意する必要があります。そのために、F'因子がないとプロリン要求性になることを利用して、M9最少培地で選択をかけるなんてことします。XL1-BlueなどではF'に薬剤耐性遺伝子をのせてあり、選択が容易、確実になるように工夫されていますけど。

継代には抗生剤入りプレート 削除/引用 No.10699-3 - 2022/08/10 (水) 06:37:29 - m 継代には抗生剤入りプレート、コンピタント作成時は抗生剤なしでやってました。 最近は怠けて、コンピタントから直接コンピタント作ります。

(無題) 削除/引用 No.10699-2 - 2022/08/09 (火) 23:25:14 - zam > Rosetta(DE3)、BL21(DE3)pLysSのような内在性のプラスミドをもつ菌株は抗生物質を含む培地で培養したほうがよいのでしょうか。 その方がよいと思います。

コンピテントセル作成 削除/引用 No.10699-1 - 2022/08/09 (火) 22:01:26 - bio 大腸菌のコンピテントセル作成に関する質問です。 DH5α、JM109のような内在性のプラスミドを持たない菌株は、抗生物質なしの培地で培養してコンピテントセルを作成しますが、Rosetta(DE3)、BL21(DE3)pLysSのような内在性のプラスミドをもつ菌株は抗生物質を含む培地で培養したほうがよいのでしょうか。 よろしくお願いいたします。

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