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(無題) 削除/引用 No.10697-12 - 2022/08/12 (金) 10:15:00 - G25 >回復培養の要否は静菌作用か殺菌作用かの違いではないでしょうか？ とう言うわけでななく、元の書き込みによるように抗生物質がタンパク質合成阻害作用か、それ以外、アンピシリン等であれば細胞壁合成阻害かですね。 一方、タンパク質合成阻害のほうが「選択圧が強いから回復培養を長くとる」という説明も適切でない。 薬剤耐性を獲得するのには耐性遺伝子の産物であるタンパク質が十分に発現していることが必要で、それを待つための回復培養です。それなしに選択培地にまいたら、薬剤耐性をもたらすはずのタンパク質が発現する前にタンパク質の合成が止められてしまう、という理屈から言って当然の話。

(無題) 削除/引用 No.10697-11 - 2022/08/10 (水) 11:17:28 - G25 >Ampのみのプレート培養で得られた形質転換体を、Amp/Cmの液体培養に植菌しましたが、増殖しませんでした。 ということは、単純にpRAREが脱落しているということでしょう。 >作成時にpRAREの脱離してしまった可能性も考えて、何もプラスミドを加えずに形質転換処理を施し、クロラムフェニコールのみを含むLB培地に播いた場合、コロニーが得られました。 脱落した細胞もいれば、保持している細胞もいて、保持した細胞だけが生えただけでしょうね。どれくらい希釈してまいたかわかりませんが、細胞がすべてpRAREを保持していればコロニーどころか一面べっとりLawnになるでしょう。コロニーとして生えたなら、pRARE保持細胞の割合がよほど少なかったんじゃないでしょうか。ある程度、高い割合でいたなら、たまたまpRAREを保持している細胞が形質転換されて二重薬剤選択で生えてくるのもいたかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.10697-10 - 2022/08/09 (火) 22:15:24 - bio G25様、ご解答ありがとうございます。 > Cm培地に植えかえても生えてこないわけですか？ Ampのみのプレート培養で得られた形質転換体を、Amp/Cmの液体培養に植菌しましたが、増殖しませんでした。

(無題) 削除/引用 No.10697-9 - 2022/08/09 (火) 22:14:37 - th >クロラムフェニコールの方が選択圧が強いです。ですので、クロラムフェニコールを入れる場合は回復培養として 回復培養の要否は静菌作用か殺菌作用かの違いではないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.10697-8 - 2022/08/09 (火) 22:10:29 - bio o様、解答ありがとうございます。 > ひとまず回復培養をするのをおすすめします。 回復培養はご指摘の通り、1時間取っております。

(無題) 削除/引用 No.10697-6 - 2022/08/09 (火) 22:02:23 - o アンピシリンは細胞壁合成阻害、クロラムフェニコールはタンパク質合成阻害なので、クロラムフェニコールの方が選択圧が強いです。ですので、クロラムフェニコールを入れる場合は回復培養として形質転換後に1hほどの培養時間を挟むことが多いです。一方、アンピシリンのみで選択する場合は回復培養せずとも生育する印象です。ですので、ひとまず回復培養をするのをおすすめします。

(無題) 削除/引用 No.10697-5 - 2022/08/09 (火) 22:02:17 - G25 > また、試しに、アンピシリンのみを含むLB寒天培地で実験したところ、形質転換体を得ることができました これをCm培地に植えかえても生えてこないわけですか？

(無題) 削除/引用 No.10697-4 - 2022/08/09 (火) 21:54:15 - zam まず、（pET系プラスミドにある）目的遺伝子の全長産物は宿主に対して毒性があり、かつ、途中で翻訳終了した不完全産物は宿主に対して毒性がないものと仮定します。 Rosetta(DE3)はIPTG無しでもT7系のリークがあるので、低レベルながらも目的遺伝子が転写され、全長が翻訳されるため、その毒性のために宿主は増殖できない。したがって形質転換体も取れない。アンピシリンとクロラムフェニコールを含む培地で形質転換体が得られなかったのは、このためと考えられます。 しかし、pRAREが脱落すると、レアコドンの部位で翻訳が終結した不完全産物となり、宿主が増殖し、形質転換体が得られる。アンピシリンのみを含む培地で形質転換体が得られたのは、このためと考えられます。 もしこれが原因ならば、さらにpLysSを持つホストならば形質転換体が得られる可能性があります。

形質転換 削除/引用 No.10697-1 - 2022/08/09 (火) 17:43:47 - あつし 形質転換に関する質問です。 現在、大腸菌を宿主として組換えタンパク質の発現に関する実験を行なっています。タンパク質遺伝子をクローニングしたベクター(pET系、アンピシリン耐性)が調製できましたので、Rosetta(DE3)に形質転換処理をして、クロラムフェニコール(終濃度30 ug/mL)とアンピシリン(終濃度 100 ug/mL)を含むLB寒天培地で培養したところ形質転換体を得ることができませんでした。また、試しに、アンピシリンのみを含むLB寒天培地で実験したところ、形質転換体を得ることができました。市販されているRosetta(DE3)からコンピテントセルを自作しているので、作成時にpRAREの脱離してしまった可能性も考えて、何もプラスミドを加えずに形質転換処理を施し、クロラムフェニコールのみを含むLB培地に播いた場合、コロニーが得られました。 クロラムフェニコールとアンピシリンのセレクションで形質転換体が得られなかぅった理由として他に考えられる要因はありますか。 よろしくお願いいたします。

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