BioTechnicalフォーラム [ELISAのブランク吸光度のばらつき]

ELISAのブランク吸光度のばらつき

No.10692-TOPIC - 2022/08/07 (日) 13:31:03 - ゆーさん

抗原を直接固相化するタイプのELISAの立ち上げを行っているのですが、ブランクの吸光度が0.2〜0.07とばらついており困っています。奇妙なのがブランクが高い時、検量線の吸光度
も高くなるかといわれたらそうでもなく、ひどいときは検量線の吸光度よりブランクが高くなることもあります。

手順としては
・抗原をPBSでプレートに固相化（4℃、O/N）
・ブロッキング
・一次抗体（PBS-Tで希釈）
・ビオチン-二次抗体（PBS-Tで希釈）
・ストレプトアビジン-HRP（PBS-Tで希釈）
・TMBで発色、硫酸で停止

ブロッキングに関しては牛由来のたんぱく質成分が入った市販の物を使用していますが、ブロッキング剤のビオチンが反応している可能性があるのかなと思っています。
しかし仮にブロッキング剤の影響があるならば、全てのウェルが常に一定の吸光度を叩き出すのではないかと考えおり
・検量線の吸光度よりブランクが高くなる
・ブランクのばらつき
に対しては説明がつかないような気がしています。
ご助言いただけないでしょうか。
　

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サンドイッチはどう？

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No.10692-8 - 2022/08/09 (火) 03:24:36 - iiii

ご質問の回答とは異なってしまい恐縮ですが、ELISAの立ち上げで検量線用の抗原があるのでしたら抗体をもう一つ探してサンドイッチ法の検討もしたほうがいいかと思います。当方も直接法の検討をしたことがあるのですがなかなか吸光度が安定せずサンドイッチ法に切り替えたところきれいに検量線が描けたのでこちらに切り替えた経験があります。

(無題)

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No.10692-7 - 2022/08/09 (火) 02:12:45 - おお

＞ブレ幅で言うと0.2-0.07=0.13
個人的にはこれって結構大きいと思うのだが、、、

吸光度と見た目の発色がだいたい一致してますか？0.2ぐらいなら発色が目で確認できるでしょう。そうでないならWELLのそこの傷とか外側の汚れとかの可能性も高いです。

発色が見た目と一致するときは洗いなどの操作が不十分で取り除けてないものがあったりするとか、Well間どうしでコンタミしているとか。たとえばチップの先に泡ができて弾けたものが離散して関係のないWellに入っているとか。

(無題)

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No.10692-6 - 2022/08/08 (月) 11:57:18 - 774R

機種依存文字だと思いますが、吸光度が0.2〜0.07が何のことかと思ったら、～（から）という意味のようですね。

どのような検出系でやっているのか分からないので、なんとも言えませんが、ブランクの値としては妥当な範囲じゃないかと思います。ブレ幅で言うと0.2-0.07=0.13ですよね？

逆に、検量線の吸光度が0.2よりも低いこともあるということですよね？　そっちの方が問題じゃないですか？ちゃんと直線性が出てますか？
欲しい方のシグナルが弱すぎて、バックグラウンドのバラつきに埋もれてる状況ではないかと想像しますが、

(無題)

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No.10692-5 - 2022/08/08 (月) 10:02:42 - zam

失礼を承知で申し上げますが、質問のような現象があったときに、真っ先に疑うべきは、コンタミネーションです。

コンタミネーションを防ぐ対策は取っておられますか？

(無題)

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No.10692-4 - 2022/08/07 (日) 22:05:41 - 散々

プレートウォッシャーやプレートリーダーの癖で
特定の位置のwellのノイズが高いとか。

ウォッシュの時にチップでwellの底をこすってキズを
付けてしまうとノイズになる。

(無題)

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No.10692-3 - 2022/08/07 (日) 21:06:52 - qq

ブランクは具体的に何でしょうか？
検量線の独立変数は1次抗体なのでしょうか、それとも固定化する抗原なのでしょうか？