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(無題) 削除/引用 No.10690-8 - 2022/08/07 (日) 12:04:32 - s 追記です。 マーカーについては、これ以上ないくらい丁寧にアプライしましたところcbbで見える範囲では消えたので、私の手技的な問題だったと思います。恐らくゲル板の斜め部分が多少入れにくい角度になっていて、よほど下手くそにアプライしまくっていたのだと思います。お騒がせしました。

(無題) 削除/引用 No.10690-7 - 2022/08/07 (日) 11:06:38 - s わかりづらかったアンド追記ですが 現所属のラボで自作ゲルで泳動し始めたのがここ1週間くらいで、同じタンパク質サンプルとマーカーしか流していません（他のシステムでこのサンプルを流したことはないです）が、マーカーのレーン自体（サンプルと一緒に流しても単独でも）は綺麗です。サンプルが横長になる現象はサンプルを入れると毎回起きています。 マーカー混入については、ほぼ100パーある気がします（練習用に泳動した時など気づいていない時以外） サンプルのとマーカーのレーン以外のレーンにもマーカーが出てきていています（見る感じはすべてのレーンではないです。）が、サンプルのレーンは必ずマーカーがみられます。 かなり丁寧にアプライした泳動結果が今日出るので、それで手技の問題が装置かゲルの問題なのかだいたいわかる気がします。 泳動は160v 55 minでやっています。

(無題) 削除/引用 No.10690-6 - 2022/08/07 (日) 10:46:08 - s 皆様ありがとうございます。 研究者としてはひよっこもひよっこなのですが、sds-page自体は数年間の経験があり、今回主にプレキャストゲルを使ってる研究室で実験しているのですが、自作のゲルやりたい実験があってゲルの組成などは昔いたラボと同じ系を使っています。昔いたラボでも私自身はこう言った現象は起こらず、マーカーで挟めば大丈夫という話を聞いておりますし、もしかしたら今回のも許容範囲かもしれません。 試薬は新たに購入、調整したものが多く、試薬系統だとバッファーのpHのずれが一番可能性あるかとは思います。あとは、2x sample bufferは他のグループから貸してもらったのですが、ちょっと怪しいので別のサンプルバッファーを検討してみます。 泳動槽自体は古いものを使っているので、そこが悪い可能性もありそうです。 ゲル板は一応もう一回洗うついでに確認してみましたが。普段の洗いで不十分というような感じではなかったです。 とりあえずシステム面としては、 濃縮ゲルの濃度を4.5パーにしつつ、プレキャストのゲルでも泳動してみます。

(無題) 削除/引用 No.10690-5 - 2022/08/07 (日) 08:13:46 - まさかとは思いますが １レーン間を空けてもマーカーが検出されるということは、もはやサンプルの中にマーカーが混入してる可能性があるのでは？ サンプルバッファ―のつもりでマーカーを加えてしまったとか？

(無題) 削除/引用 No.10690-4 - 2022/08/07 (日) 05:26:48 - zam 私が大昔、初心者の頃の失敗談を書きます。 ウェル内の残液やゲル破片を洗浄除去しないままサンプルをアプライしたことがあり、ウェルに入りきらなかったサンプルが漏れて隣のウェルに混入し、トピ主さんと類似の状況になったことがありました。以後、そのような失敗はありません。 手技以外の原因となると、装置（特に電極の劣化の可能性）かゲルが怪しいように思われます。 他のラボで作ってもらったゲルなり市販のゲルを使うなりしても、同様の現象が起こるなら、泳動槽やパワーサプライに問題の原因があるかもしれません。 逆に泳動槽やパワーサプライを変えても同様の現象が起こるなら、ゲルに問題があるかもしれません。 ゲルに原因があるとすると、真っ先に疑うのが試薬やバッファーです。 pHが違っていたとか、秤量が狂っていたとか、TEMEDの瓶の蓋が開けっぱなしだったとか水が入ったとか、古い試薬を使っていたとか、考えれば全てが怪しいです。 トピ主さんが初心者かどうか存じませんが、初心者にありがちなミスを書きます。違っていたらご容赦ください。 ・液量を間違えた。 ・古いAPS溶液を使った。 ・汚れたゲル板を使った。 ・分離ゲルと濃縮ゲルのバッファーを取り違えた。 ・分離ゲル作成時に水を重層しなかった。 ・重層時に境界面が乱れた。 ・ゲル境界面が不明瞭なまま、濃縮ゲルを重層した。 ・濃縮ゲルを重層する際に、水が残っていた。

(無題) 削除/引用 No.10690-3 - 2022/08/07 (日) 00:02:04 - ４５６７ SDS-PAGE gel作成の適当さゆえ人様にコメントできるような人間でない私ですが、そういうことは経験ないです。レーンを空けずに隣接して泳動する限り、overloadingや塩濃度の影響でレーンが太くなることはあっても横方向に拡散してレーン同士がつながることはありません。 以前からずっとでしょうか、それとも最近急にでしょうか。何か試薬を変えたり、新規に購入したりしてませんか。アクリルアミドとかが不良品とか。使用してる試薬や機材などに起因する何か系統的な原因にように思われます。 あと泳動時間はどのくらいですか。あまりにもゆっくり電気泳動するとバンドは横方向にも縦方向にも拡散気味になります。（早くと流すとバシッとダブレットバンドでに分かれるけど、ゆっくり流しすぎると拡散して１本にしか見えないとかあります）これは低分子量のタンパク質でしばしばみられます。

(無題) 削除/引用 No.10690-2 - 2022/08/06 (土) 18:08:09 - おお まず、濃縮ゲルはオリジナルのプロトコールで３.７５％。ただ、それでもゆるくて扱いにくい場合もあるので４％以上のプロトコールも見かける（１２％で分離するならどうせ高分子は分離できないのだから濃縮ゲルは６％ぐらいでも影響ないだろうけど、そう極端に上げなくても５％程度あればやりやすいはずと書いたが、１５０kDａときずいた、、、分離ゲル８とか１０％で良くない？で濃縮ゲルは４．５％ぐらいかな）。それが原因かどうかわからないが、ゲルがうまくできなくなる可能性は通常のプロトコールよりは高いように思う。 ゲルを立てるガラスプレートが汚いと汚れがあるところで重合が阻害されやすい。特に濃縮ゲルと分離ゲルの境目は影響受け易くて、分離ゲルと濃縮ゲルの間に未重合の部分ができることも多いい。 プレートはラボ用器具洗浄用の洗剤にしばらくつけ、指でこすりながら汚れをおとす。水をかけたとき、水が弾かれる部分はまだ汚れているので、そういうところがあればそこを重点的に洗い直す。汚れてないプレートは水を弾かず水で全体が覆われたままの状態みなる。 ゲル板を立てたあとアルコールでフィルして汚れを落とすなどアルコールを使う人もいるけど、私はあまりしないので要領はわからない。

SDS-PAGEでサンプルが横に広がる。 削除/引用 No.10690-1 - 2022/08/06 (土) 16:39:57 - s sds-pageで精製済みのタンパク質サンプルを流しているのですが、サンプルのレーンが横に広がっていきます。それだけなら良いのですが、マーカーがサンプルレーンに検出されるので、現在トラブルシューティングを起こっています。 タンパク質量は1 μg/laneですが、1／5量での実験でも同様なこと（現在実験中ですが、横にひろがっていきます）が起こります。 ゲルは自作の3%濃縮ゲルと12%分離ゲルです。 泳動の様子を観察すると濃縮ゲルを進んでいく段階でサンプルがだんだんサンプル孔同士の穴にある仕切りとなっている濃縮ゲルを浸食？透過？していって、最終的には一部つながってるのはないか程度にまで広がりました。 原因としては 濃縮ゲルの組成orバッファーの作製ミス？ 単純にタンパク質濃度が濃すぎる 2x sample bufferに問題がある？ 他にも陰極側の層が小さくかつ、結構水流？泡の流れ？が発生するので、そこで何かサンプルが拡散されるような現象が発生している可能性 など考えられる気がしますが、皆様のご経験等からどこに問題がありそうでしょうか。 現在はマーカーとサンプルのレーンを離さずに、サンプルを挟み込むように配置していますが、サンプルとの間に1レーン開けた際もサンプルレーンにマーカーが紛れ込んでいました。 サンプルが横に広がる現象とマーカーのコンタミは独立の現象の可能性も考えてはいますが、100発100中でマーカーがサンプルのレーンに見えてきますので手技以外の面を考えています。 サンプルは150 kDa程度のタンパク質です。 よろしくお願いいたします。

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