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(無題) 削除/引用 No.10673-9 - 2022/07/31 (日) 11:18:17 - おお >[Re:5] siさんは書きました : > 素人ゆえに一口でリポフェクタミンと言っていたのですが、サーモ製のRNAiMAXです。いわゆる改良されたものですよね？ > 宣伝情報を鵜呑みににして、かなり良さそうと思って購入したのですが、これで相性の関係でうまくいかないことおもあるのでしょうか？ 実際に毒性がでてますからねぇ。カタログとかは改善されたところをメイン（強調して）に特徴など書きますから、どんな場合も良くなると思ってしまうというのはあるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.10673-8 - 2022/07/31 (日) 01:53:35 - rtghjk そうですね、Control実験が欠けてますね。 トランスフェクション試薬 単独　および　トランスフェクション 試薬 + スクランブルRNA。の２つの対照群を追加してみましょう。原因がどこにあるか特定できると思います。 あと細胞は免疫系の細胞とかではないですか。

(無題) 削除/引用 No.10673-7 - 2022/07/30 (土) 21:28:19 - zam > そもそもリポフェクタミンに直接関係がないのかわかっておりません。 本実験の前に予備実験で条件検討はしましたか？ トランスフェクション条件は細胞によって異なります。特に初代培養細胞の場合は、マニュアルの条件も、別の細胞の条件も、当てにならないことがあります。その細胞の既報があるなら参考になるかもしれません。 ポジコンやネガコンは何で取ってますか？

(無題) 削除/引用 No.10673-6 - 2022/07/30 (土) 19:34:57 - rtghjk RNAiMAXもリポフェクタミンもリポソームによる導入と思いますので類似の導入様式ですのでこれらで好ましくない影響が出るようでしたら、導入様式の異なるタイプ（非リポソームタイプ。カチオンなどを介した方法）の試薬で試してみたらどうでしょうか。また超古典的なCalcium phosphate法は下手な市販品よりもむしろいい感じで使えることもあると聞きます。その他、遺伝子導入に伴う細胞のストレスをおさえるようにデザインされたCHAMPと呼ばれる新しいタイプのトランスフェクション 試薬も市販されています。

(無題) 削除/引用 No.10673-5 - 2022/07/30 (土) 15:46:42 - si 素人ゆえに一口でリポフェクタミンと言っていたのですが、サーモ製のRNAiMAXです。いわゆる改良されたものですよね？ 宣伝情報を鵜呑みににして、かなり良さそうと思って購入したのですが、これで相性の関係でうまくいかないことおもあるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.10673-4 - 2022/07/30 (土) 14:34:25 - おお primary transfectionでググってみるといいかもね。エレクトロポレーションのたぐいで、NUCLEOFECTORは優れてるようで神経細胞のプライマリーに入れている人がいた。レンチとか使えると楽かも知んない。

(無題) 削除/引用 No.10673-3 - 2022/07/30 (土) 13:40:02 - rtghjk siRNAの実験ではトランスフェクション 試薬と培養細胞の相性みたいなものがあって、合わないと導入効率がものすごく低かったり、細胞が死んだりします。こうした傾向は特に初代培養細胞などではしばしば顕著です。これが何によるものかはわかりませんが、実験条件の工夫とかではおそらく対処できないもっと根本的な原因と思われます。リポフェクタミンは昔からあるので使用実績も多い印象があるかもしれませんが、最近は導入効率が高く、細胞毒性の低くなるように改良されたトランスフェクション 試薬が様々なメーカーから次々販売されています（導入の機序もいろいろでリポフェクタミンとは異なるものも多いです）。またこれまでに適用実績のある細胞株のリストが出ているものもありますし、なくてもメーカーに聞けばたぶん教えてくれると思いますので、使用されている細胞でこれまでに適用実績があるかどうかもわかります。こうした試薬はモニターキャンペーンで無償頒布したりすることもあります。なので他のトランスフェクション 試薬も検討してみてください。

(無題) 削除/引用 No.10673-2 - 2022/07/30 (土) 11:25:13 - おお リポフェクタミンの影響ならリポフェクタミン単独でやってみればいいでしょうけど、まあたいていリポフェクタミンの毒性ということが多いと思います。リポフェクタミンを減らせば改善すると思いますが、混ぜる核酸とリポフェクタミンの割合は同じにしておいたほうが無難です。ただし効果が弱いなら核酸の割合を上げることもありと思うのでリポフェクタミンを減らした状態で核酸の割合を振って予備実験をしてもいいかもしれません。ただし最適な割合があるとも言われているので多く核酸を使っても効率が落ちることはあります。 Transfection試薬も多様になってきていますので、サンプルとかで貰えそうなものなどを中心にいろいろ試してみるのも手だと思います。ポフェクタミンならLipofectamine LTXとか低毒性のものもあるし、siRNAに特化したものもあるんじゃなかったっけ。 細胞が長期培養が難しいものみたいですが、siRNAはすぐには聞かないことが多いです。なぜならmRNAがなくなったりTranslationが阻害されても、すでに合成されたたんぱくは細胞で機能しているわけで、その半減期がながいといつまで立ってもたんぱくは減らないということになりますから。７２時間ぐらいは見ることがまあまああります。また分裂するようであれば分裂によって細胞個数あたりのタンパク量も減りますから。あまり分裂しない細胞でやったことはないですがどんなもんでしょうかねぇ。

siRNA作業により細胞が死んでしまう時 削除/引用 No.10673-1 - 2022/07/30 (土) 07:53:57 - si siRNA作業により細胞が死んでしまう時、どうされますか？ リポフェクタミンの有無で目視で細胞の状態が大きく違ったので、リポフェクタミンが影響していると考えています。 濃度はマニュアルに掲載の以下の通り行いました。 A. Lipofectamine 3ul + opti-MEM 50 ul B. siRNA (10nMに希釈済み) 1ul + Opti-MEM 50ul A + Bを混合し、50 ulずつwellに入れる。 安易にリポフェクタミンだけを少なくすれば良いのか、合わせてsiRNA (現在10nM)も減らす必要があるのか、そもそもリポフェクタミンに直接関係がないのかわかっておりません。 初代培養細胞で6時間に１度mediumを交換してようやく24時間超生き残れるような細胞を用いています。当方siRNA素人のため、別スレにて、別細胞で練習する件は質問させていただいております。 どなたかご意見をいただけますと幸いです。

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