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(無題) 削除/引用 No.10672-8 - 2022/08/10 (水) 10:10:38 - おお siRNAなど、mRNAのところで抑制が効いても発現しているたんぱくとどまっているので効果が現れるのに時間がかかると言われています。特にsiRNAは供給されつづけるということでもなく（まあリポフェくタミンなどを入れっぱなしに出来はしますが）、細胞内のsiRNAも培養しているうちに減るでしょう。なので２度Transfectionしているのも見かけられます。

(無題) 削除/引用 No.10672-7 - 2022/08/10 (水) 09:17:57 - ww あ、言葉足らずでした。 条件検討は濃度の他に、時間も振っています。 1day, 2day, 3dayとか。 どれくらい条件を振るかは、それぞれの好みによるかと思います。

(無題) 削除/引用 No.10672-6 - 2022/08/09 (火) 22:08:07 - si 本当にありがとうございます。濃度計算はいつもとても怖いので、確認いただけて本当に助かります。 10nMで24hして、効果がなく、培養時間を伸ばして対応と思っているのですが、濃度で対応(100nM)も検討しないといけない時がくるかもしれないのですね(費用が嵩むので避けたいですが)。

(無題) 削除/引用 No.10672-5 - 2022/08/09 (火) 14:57:48 - ww > A. Lipofectamine 30ul + OPTI-MEM 500ul > B. siRNA 1ul+OPTI-MEM 500ul > A+Bを混合し、1000ulを10cm dishの培地9mlに加える。 5nmolのsiRNAを50ulに溶かして100uMストックを作成したということですね。 上記Bで加えるsiRNAの濃度が100uMなら、計算は合っています。 > 正直思っているよりずっと安いので、 オリゴなので、価格は大体そんなものかと思います。 ただ、私は初めて試すsiRNA実験では例えば濃度を100,10,1nMとかに振って、至適条件を探すので消費量が多くなる場合もありました。 ご参考まで。

(無題) 削除/引用 No.10672-4 - 2022/08/09 (火) 05:21:35 - si 表記を間違えていました。 ストックストックsiRNAは100uMでした。 5nMで購入後50ul PBSで溶かしております。 10cm dishesに10nMsiRNAの介入試験を行いたいのですが、以下の計算で合っていますでしょうか？どなたかご意見ください。 A. Lipofectamine 30ul + OPTI-MEM 500ul B. siRNA 1ul+OPTI-MEM 500ul A+Bを混合し、1000ulを10cm dishの培地9mlに加える。 この計算があっているとすると、3万円で10cm dish (6wellでも)40-50皿分になります。 正直思っているよりずっと安いので、本当に計算があっているのか不安です。 経験者の方あるいは濃度計算の得意な方、ご意見いただけますと幸いです。

(無題) 削除/引用 No.10672-3 - 2022/08/01 (月) 01:29:17 - si wwwさん本当に助かります。ありがとうございます。 非常にわかりやすくてマニュアルの見方も10cmの計算も納得できました。

(無題) 削除/引用 No.10672-2 - 2022/07/31 (日) 19:33:06 - ww 10cm dishに加える培地の量は何mlを予定していますか？ 参照されたマニュアルに、vol of plating medium等の記載があるはずなので、 それを参考に決めれば良いと思います。 あと、マニュアルの解釈を間違えていませんか？ > A. Lipofectamine 3ul + opti-MEM 50 ul > B. siRNA (10nMに希釈済み) 1ul + Opti-MEM 50ul > A + Bを混合し、50 ulずつwellに入れる。 (5pmol/wellになるようです) この調整方法では、A+Bの最終体積は104ulで、siRNAの濃度は0.1nM(正確には0.096nM)になります。 これを培地に加えるとさらに薄まってしまい、通常用いるsiRNAの濃度(数nM-数10nM)としては薄すぎます。 「10nMに希釈済みのsiRNAを1ul」ではなくて、 「siRNA 1ulを上記容量で加えて、A+B中で10nMに調整する」という 意味でマニュアルに書かれていたのではないですか。 例えば10cm dishで培地10mlを用いて培養するなら、 A. Lipofectamine 30ul + OPTI-MEM 500ul B. siRNA(例えば1000nM) 10ul+OPTI-MEM 500ul A+Bを混合し、1000ulを10cm dishの培地9mlに加える。 この場合、培地中のsiRNA濃度は約1nMになります。 参考まで。

siRNA濃度の計算 削除/引用 No.10672-1 - 2022/07/30 (土) 07:44:25 - si siRNA素人です。一度、初代培養細胞でsiRNAを行ったのですが、リポフェクタミンの毒性なのか細胞が死んでしまいました。 そこで、培養の簡便さも踏まえC2C12 cellを10cmディッシュで培養して、siRNAを行ってみたいと思っていますが、濃度計算に困っています。 購入品はサーモで買えるような一般的？（youtubeに動画あり、以下の濃度検索すればすぐに出る）なものです。 ------------------------------------------------------------- siRNAを100nMでストックしています。 (購入時5uM siRNA/50ul water) 最終濃度10nM siRNAを10cmディッシュ (10ml)で培養したいと思っています。1Wellに加える量は1mlを考えています。 どなたかご親切な方siRNA、リポフェクタミの必要量の計算をご教授いただけないでしょうか？ ------------------------------------------------------------- なおマニュアルには、24wellあるいは6 wellを例に以下の通り記載があります。 24well A. Lipofectamine 3ul + opti-MEM 50 ul B. siRNA (10nMに希釈済み) 1ul + Opti-MEM 50ul A + Bを混合し、50 ulずつwellに入れる。 (5pmol/wellになるようです) 6 well A. Lipofectamine 9ul + opti-MEM 150 ul B. siRNA (10nMに希釈済み) 3ul + Opti-MEM 150ul A + Bを混合し、250 ulずつwellに入れる。 (25pmol/wellになるようです)

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