BioTechnicalフォーラム [トランスフェクション　DNA析出]

トランスフェクション　DNA析出

No.10662-TOPIC - 2022/07/26 (火) 21:30:05 - ビギナー

初めまして、最近トランフェクション導入の実験を始めたものです。
皆様にご質問がございます。

DNAをOpti-MEMに溶解する際、高濃度のもので糸くずのようなものが析出する現象が発生しました。
DNAの濃度は推奨の濃度でしていますし、OptiMEMも新しく購入したものになります。
DNAはTEバッファー溶液にて保存しているのですが、TEバッファー溶液に溶解時時は見えず、Opti-MEMに溶解した際に析出するようです。

ThermoFisherのトラブルシューティングを見たり、周りの方に聞いたりしたのですが原因がわからず途方に暮れております。　
何か良い解決法がありましたら教えていただけますでしょうか。　どうぞよろしくお願いいたします。
　

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No.10662-12 - 2022/08/05 (金) 09:07:38 - LPS

トランスフェクション、試してみたらどうですか。そのままと、軽く遠心して沈殿を除いたものと。
とりあえずは、プラスミド、フェノクロ、エタ沈をやってみるかな、と思います。

X tremeで発現したら？

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No.10662-11 - 2022/08/05 (金) 05:11:48 - m

X tremeで発現したら？
Xーtremeの方が、シンプルで発現量も多かったので、リポフェクは辞めました。
そのままリポフェクでやるなら、DNA を水である程度希釈すれば、いいのでは？

(無題)

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No.10662-10 - 2022/07/31 (日) 18:59:07 - おお

Opti-MEMが怪しいということなら、無血清DMEMなどを代わりに使ってみてもいいかもしれない。Opti-MEMがなかった時代ではマニュアルにもDMEMなど使えと書かれていた。

(無題)

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No.10662-9 - 2022/07/31 (日) 18:38:09 - 散々

researchgateにも同様のトラブル事例が相談されているから、
何らかのOpti-MEM中の成分とDNAが塩を形成してるのだろう。
取説に、カチオン性のトランスフェクション試薬と併用しろ、と、
わざわざ、カチオン性試薬と念押ししているところが怪しく、
スペルミンかスペルミジンとか何かが加えられてるんじゃなかろうか。

(無題)

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No.10662-8 - 2022/07/30 (土) 21:55:47 - zam

> DNAはTEバッファー溶液にて保存しているのですが、TEバッファー溶液に溶解時時は見えず、Opti-MEMに溶解した際に析出するようです。

一度DNA/TE溶液を遠心してみては？目視で見えなくても、ひょっとしたら不溶物が存在するかもしれない。

そもそもどうやってDNAを調製しましたか？そこに原因があるのでは？

(無題)

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No.10662-7 - 2022/07/27 (水) 17:13:22 - おお

プラスミドをエタ沈したときのアルコールが抜けきってなくって、そのアルコールのせいでOPTI MEMのタンパク成分（BSAなど）が沈殿したとか。
よく原因がわからないにしても、エタ沈をして水かTEに溶かし直してみる価値はあるかも。そのDNA（プラスミド？）、電気泳動でものであるか確認してますよね？

(無題)

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No.10662-6 - 2022/07/27 (水) 15:28:25 - 774R

>また、同じOptiMEMを使用し、他のpDNAをトランスフェクションした際は
析出しておりません。
>このようなことからDNAが原因かなと考えておりました。

他のプラスミドDNAでは析出しないという経験がおありなら、なおさらプラスミドDNAはOptiMEM中で析出しないだろうという考えに至らないでしょうか？
実際、一般的にDNAは水溶媒に対しては良く溶ける物質です。もしOptiMEMで析出しやすいのだとしたら、世界中で問題が発生し、少なくともQ＆Aやトラブルシューティングなどに記載されるレベルでしょう。

>DNAではないとしたら、他に何か原因が考えられますでしょうか？

私の知見ではプラスミド精製の段階で混入しうる物質でTEには溶けてOptiMEMで析出する物質は思い当たりません。

>また、析出が見られたとしても、ＤＮＡでなければトランスフェクションに影響がないと考えてよいでしょうか？

何が析出してるのか分かりかねるので、影響があるかないか想像もつきません。

(無題)

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No.10662-5 - 2022/07/27 (水) 13:24:25 - ビギナー

774R様

お忙しい中コメントを下さりありがとうございます！

DNAはTE Buffer溶液中で保存しておりますので、試しにTE Bufferを
OptiMEMに添加してみましたが、
塩のようなものが析出してきませんでした（当然かもしれませんが、、、）

また、同じOptiMEMを使用し、他のpDNAをトランスフェクションした際は
析出しておりません。

このようなことからDNAが原因かなと考えておりました。

DNAではないとしたら、他に何か原因が考えられますでしょうか？
また、析出が見られたとしても、ＤＮＡでなければトランスフェクションに影響がないと考えてよいでしょうか？

ご教授いただけますと幸いです。

よろしくお願いいたします。

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No.10662-4 - 2022/07/27 (水) 11:41:55 - 774R

析出した物質はDNAではないと思います。
DNAだと思う根拠はありますか？

(無題)

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No.10662-3 - 2022/07/27 (水) 09:34:56 - ビギナー

おお様

お返事ありがとうございます！大変うれしいです。
使用しているのはLipofectamin LTXになります。

今回の場合はLipofectaminLTXを混ぜる前、DNAとOptiMEMを混ぜた段階で
析出してしまっております。

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No.10662-2 - 2022/07/27 (水) 01:10:01 - おお

p3000 lipofectamine ３０００をお使いなら、p3000がよく混ざってないとDNAを入れたときに沈殿ができたりするようです。