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(無題) 削除/引用 No.10660-10 - 2022/07/28 (木) 12:04:05 - VGHUI ありがとうございます。自己流の適当な解釈なんですがOHラジカルとかかなあとか思ってます。あれ側鎖に変なことするだけでなくペプチド結合も切るとかメカニズムは忘れたんんですが、大学の時の生化学の授業で習ったので。ていうのが今回、ラジカルスカベンジャー入れてなかったのです。なので今度DMSO入れてみて多少改善するかもみてみようかなと思います。

(無題) 削除/引用 No.10660-9 - 2022/07/28 (木) 11:30:00 - toto チップ式ということは直接発振してる金属にサンプルが触れるわけですか？毎回洗わないと行けないので面倒な気がしますが、もしそうならば、微量でもあり、ペプチド結合でも局所的な真空の形成か原子間の距離の変化によって切れることもありそうです。ちなみにうちのラボではcup cornタイプの超音波発生装置でtubeをコーン状の中につけて行う形でやってますが、マックス出力でも大部分は切れることは経験してません。蛋白に加わる力がどれくらいかでしょう。 細胞抽出液のDNAの粘性を減らすにはSDS溶液のbufferを除いて、代わりに1mM HClを入れる手もあります。DNAは酸性で弱いので、ピペッティングだけでさらさらになります。中性にして、アプライすれば問題なく泳動します。昔はよくやってました。

(無題) 削除/引用 No.10660-8 - 2022/07/28 (木) 02:02:20 - おお >[Re:7] UGHUIさんは書きました : > 皆様ありがとうございます。 > 出力は0~25のうちの３で行いました。間隔空けて5秒x４回です。 ていうかあんまり科学的ではないんですよね。どれくらいのエネルギーが出たのかちっともわからない。 >いつもと違うのは液量がすごく少ない(いつおは500-1000μlくらいですが、今回は80μlくらい)ことです。 ちょっと違う方法をかいておきます。 Microtube filter に載せて遠心すると粘性を減らすことができるので、たまにそういうふうにすることがあります。 フィルターですが今は以下のURLのデブリなどを除く最初の過程のフィルターをつかってます。細胞からのRNA調製ではこのフィルターは必要ないのであまりに余りまくっていますので。手に入らないものかもしれませんが多分0.22 μmのフィルターがあればようを足すのではないかと。 https://us.vwr.com/assetsvc/asset/en_US/id/16892095/contents 0.22 μmのフィルターの例 https://www.fishersci.com/shop/products/costar-centrifugal-devices-spin-x-6/p-108067 えっと、もう一言言うと一般的に通常たんぱくに使うぐらいの強さのSonicationでそう簡単にペプチドが切れるわけでもないと思っています。そんな簡単に切れるならそもそもこのような方法論は存在しないでしょうから。例外もないといっているわけではありませんけど。

(無題) 削除/引用 No.10660-7 - 2022/07/27 (水) 19:11:59 - UGHUI 皆様ありがとうございます。 出力は0~25のうちの３で行いました。間隔空けて5秒x４回です。いつもと違うのは液量がすごく少ない(いつおは500-1000μlくらいですが、今回は80μlくらい)ことです。SDSを含むためかなり泡が立ってしまうサンプルもあるのでどのサンプルも同じような影響かあるかどうかはわかりません。 その後、Pubmedでも調べていますが、超音波処理でpeptide bond 普通に切れるみたいな昔の論文もありました。

(無題) 削除/引用 No.10660-6 - 2022/07/27 (水) 01:15:17 - おお たんぱくも切れることがあるんですね。参考になりました。私はあまり経験したことはありません。 質問に関して、出力はどれくらいですか？１から２Wで一秒というのを３から５回ぐらい繰り返せば十分粘性がおちます。温度管理も大切かもしれません。

(無題) 削除/引用 No.10660-5 - 2022/07/26 (火) 21:42:34 - LPS 超音波処理どんな条件でやってますか？ 50-150ulなら、パワーも3(of 10)、1-2秒で電気泳動に支障がないくらいにサラサラになると思いますが。

(無題) 削除/引用 No.10660-4 - 2022/07/26 (火) 19:33:05 - mp 経験あります。400kD以上のタンパクですが、ソニケーションでラダーになってしまいました。今は粘性を下げるのにbenzonaseを使ったりしています。ただその際はMgを入れる必要があります。

(無題) 削除/引用 No.10660-3 - 2022/07/26 (火) 18:57:26 - G25 経験あります。 界面活性剤で溶菌したときは予想分子量に一致する一本のバンドを示したタンパク質が、ソニケーションを加えると分子量が小さくなった二本のバンドになったことがあります。おそらく物理的応力に弱い部分があってソニケーションに耐えられずに切れたものだと思います。それ以来、どうしても必要な場合は除き、やらなくてもすむならソニケーションは避けるようにしています。

(無題) 削除/引用 No.10660-2 - 2022/07/26 (火) 18:34:29 - み 超音波でペプチド結合が切断されたとは考えにくいので、熱が発生してプロテアーゼアタックが起きやすい状態になったとか。 ハンディータイプのブレンダーミキサーや超音波処理で分解が気になったことはありません。 プロテアーゼ阻害剤は入れていますか？ SDSがある程度入っているだけでもプロテアーゼは弱まる気がしますが。

超音波処理とタンパク質の分解のこと 削除/引用 No.10660-1 - 2022/07/26 (火) 17:41:14 - VGHUI 超音波処理をやりすぎると高分子量タンパク質の分解が起こるとかありますか？細胞のSDS lysateのDNAを切るためいつもはシリンジでやってたのですが、今回は数が多くて面倒で、ついつい楽がしたくなりチップ式超音波破砕装置で処理しました。（ラジカルスカベンジャーは入ませんでした）。それで、westernしたらサンプル間でシグナルがバラバラでかつ明らかな分解（本来の分子量のところのシグナルが弱いものはその下方にラダー状のシグナルがある。）が見られました。なので次は真面目にシリンジでやろうと思うのですが、何か分解を抑える良い方法があれば超音波の方が楽なので超音波でやりたいというのもまだちょっとあります。で、DNA剪断を超音波でしてる人も多いと思うので超音波したらタンパク質が分解した経験ある方いたら教えてください。

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