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(無題) 削除/引用 No.10657-16 - 2022/08/05 (金) 03:10:16 - おお 腫瘍細胞であるなら、足場非依存的に増殖できる（教科書的には）ので、トリプシンで剥がしたあとmethyl celluloseを含む培地で一日ほど培養して細胞を回収すればまいたときにシングルセルに分離できていれば一回ぐらい分裂しているのもあるかもしれないけど、シングルセルの状態でトリプシン処理から回復したものが取れるんじゃないかな。 それでは細胞が安定しないならマトリゲル中にまくか、、、低温にするとゲルから溶液に変わるので回収するときよく冷やしてマトリゲルを除きながら細胞を回収する。。。どうかな。

(無題) 削除/引用 No.10657-15 - 2022/08/05 (金) 02:27:54 - iiii >[Re:1] あいさんは書きました : > 腫瘍細胞自体には細胞表面抗原が発現していることは確認でき、 > PBMCを用いた場合では染色された細胞が確認できるため、抗体自体には問題なさそうです。 この2点の確認はあいさん自身がやられたのですか？それとも別の人がやって「私がやったときはうまくいったよ」と言われたということですか？ それほど複雑な実験でもないでしょうし、最初に書かれた手順も大きく間違ってないように思いますので、 > PEで染色された細胞が全く検出されず、抗体がついていないと思われます。 全く検出されない、というのはどうなのかな？と思うのもわかります。フローサイトメトリーの使い方は慣れてますか？ あるいはお使いの細胞にその抗体の抗原自体が発現していない、といことは考えられますか？

(無題) 削除/引用 No.10657-14 - 2022/08/05 (金) 01:31:41 - LPS 私は5mMEDTAと書いた覚えはありませんが。

(無題) 削除/引用 No.10657-13 - 2022/08/04 (木) 17:59:42 - ema 発想を変えて、 接着したまま染色をして染まったのを観察してからはがしてFCM FCMでなく、プレートに接着したまま染色して顕微鏡でタイリングして発現を比較検討する は？

(無題) 削除/引用 No.10657-12 - 2022/08/04 (木) 15:57:00 - zam > トリプシン処理の過程を5mMEDTA/PBSに変更して行いましたが、うまくいきませんでした。 「うまくいかない」とは、 a)トリプシンを使わずにEDTAだけだと細胞が剥がれなかったということなのか、 それとも、 b)トリプシンとEDTAの両方を使ったら、染色されなかったということなのか。 a)ならば、EDTA濃度とpHと処理時間を変えて、更なる条件検討が必要でしょう。 例示の文献では、各種接着細胞に対してEDTA濃度やpHを振って、最適条件を見つけています。また、EDTA処理してピペッティングで細胞剥がしをしたりしています。 b)ならば、そもそもトリプシンを使ったら、細胞表面マーカーが分解されて、染色は難しいでしょう。 https://www.future-science.com/doi/full/10.2144/000114325

(無題) 削除/引用 No.10657-11 - 2022/08/04 (木) 11:39:39 - あい 皆様ご返事有難うございます。 >みさん、LPSさん トリプシン処理の過程を5mMEDTA/PBSに変更して行いましたが、うまくいきませんでした。 >iiiさん 文字化け申し訳ございません。 抗体濃度：サンプルシートには「10uL/10の6乗cells」としか記載がありません。細胞数は10の5乗で実験しているため1uL使用しています。 反応時間：30分で行っています。60分にしてみましたが、うまくいきませんでした。 >TECさん Accutaseを購入してみましたので使ってみようと思います。 >emaさん 4℃で行いましたが、うまくいきませんでした。 >おおさん Upcellは少々値が張るため、購入は難しそうです

(無題) 削除/引用 No.10657-10 - 2022/07/28 (木) 23:30:30 - おお >[Re:9] LPSさんは書きました : > 温度反応性のもの、検討したことありますが、価格があまりにも高くて常用は無理なので、使っていません。それとシート状に剥がれても単細胞にならなければ、使う意味がないので。 ルーティーンでこの手の解析をするなら厳しいかもしれませんね。 シート状になるかどうかはDishのさいぼうのポピュレーションと細胞間の相互作用の強さできまるとおもいます。実際に使用例としてSingle cellに懸濁するようなものも示されていたと思います。

(無題) 削除/引用 No.10657-9 - 2022/07/28 (木) 09:32:11 - LPS 温度反応性のもの、検討したことありますが、価格があまりにも高くて常用は無理なので、使っていません。それとシート状に剥がれても単細胞にならなければ、使う意味がないので。

(無題) 削除/引用 No.10657-8 - 2022/07/28 (木) 01:32:33 - おお こういう話題でいつも温度応答性細胞培養器材 UpCell はどうかとお示しするのですが、 通常培養条件の温度３７度では普通の培養用Dish、プレートとして振る舞うのですが冷やすと細胞への接着性が低下して細胞が剥がれやすくなるという素材を使った培養容器。 https://www.cellseed.com/pdf/business/product/product_data.pdf ホームページなどではコンフルの状態で低温にさらして細胞のシートが作れるという謳い文句で売り込んでいるけど、あまり細胞同士がくっついてない状態で低温に晒すとシングルセルの懸濁液が簡単に得られるし、トリプシンなどの酵素を使わないので表面抗原のエピトープが消化により失われることもない。 ということなんだが、余りそう言うので使われてないのかな、、、

(無題) 削除/引用 No.10657-7 - 2022/07/27 (水) 20:05:20 - ema 各ステップが常温になっていますが 接着しやすい細胞ならチューブ壁面にどんどん付着します。 私は全部4℃で（少し長くしてもいいから）行っています。 マクロファージではシリコン処理チューブ表面を使う、チューブ表面を濃いFBS　BSAでブロックして付着しにくいようにしています。

(無題) 削除/引用 No.10657-6 - 2022/07/26 (火) 11:17:27 - LPS マクロファージで使う方法ですが、PBで洗った後、１０mM EDTA/4mg/ml Lidocaine in PBS(-)で、３７Cで１５で１５分ほどインキュベーションして、ピペッティングしてみてください。うまくいけば、剥がれるかも。EDTAは、pHを合わせたやつをつかってください。

(無題) 削除/引用 No.10657-5 - 2022/07/26 (火) 10:50:25 - TEC 抗体のエピトープの位置とtrypsin切断位置との関係に寄るのでしょうが、、実感としてはtrypsinはすべてとは言わないまでもかなりの割合で細胞表面分子の染色性を消失させますね。一方、Accutaseはいくつかためした細胞表面抗原を保持したまま細胞を分散できました。試してみては。あと、市販のenzyme-free dissociation solutionは細胞抗原の保持は約束されるものの、なかなか単細胞にならない場合もあります。その場合でも、ピペッティングによる物理的剪断力も加えるとまあまあなんとかなります。

(無題) 削除/引用 No.10657-4 - 2022/07/26 (火) 01:40:53 - iiii >[Re:1] あいさんは書きました : > 細胞表面染色がうまくいかず困っています。 > どこか改善点など考えられますでしょうか。 1. 文字化け 2. 抗体との反応条件（抗体濃度と反応時間） 3. フローサイトメトリーの検出条件（きちんとあなたが使っている腫瘍細胞が検出できる条件で流しているかどうか？） いかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.10657-3 - 2022/07/25 (月) 21:22:53 - あの 次のようなものを使うか https://www.cosmobio.co.jp/product/detail/cell-dissociation-solution-blg.asp?entry_id=34252 あるいは、剥がさないで解析できる装置(in cell analyzer)とか使うのは いかがでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.10657-2 - 2022/07/25 (月) 19:03:44 - み 理論的にはトリプシン蛋白分解酵素で細胞膜蛋白を消化されていますから当たり前のような気がしますが、全ての標的分子が切断されるような条件なのかは疑問が残ります。 （文字化けしていて条件が読めません）

接着細胞のフローサイトメトリー 削除/引用 No.10657-1 - 2022/07/25 (月) 18:04:49 - あい 細胞表面染色がうまくいかず困っています。 使っている細胞は腫瘍細胞（プライマリーカルチャー）、抗原は細胞表面の受容体で抗体はPEが標識されたものを使っています。以下一次抗体反応のプロトコールです。 培養細胞をトリプシン処理ではがす ⇓ 必要細胞数（1×10⁵）を回収し遠心分離（1500rpm、5分、常温） ⇓ 上清を除去しペレットをbuffer（PBS/2％FBS）で再懸濁し遠心分離　×2 ⇓ 上清を除去し、buffer100µLで再懸濁 ⇓ 一次抗体を1µL（抗体のdatasheetには10µL/10⁶とだけ記載あり）加え暗室、室温で30分放置 ⇓ bufferを加え再懸濁し遠心分離　×2 ⇓ buffer500µLで再懸濁しフローサイト PEで染色された細胞が全く検出されず、抗体がついていないと思われます。 腫瘍細胞自体には細胞表面抗原が発現していることは確認でき、PBMCを用いた場合では染色された細胞が確認できるため、抗体自体には問題なさそうです。 どこか改善点など考えられますでしょうか。

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