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(無題) 削除/引用 No.10643-15 - 2022/07/24 (日) 10:10:19 - おお コロジオンアミコン->アミコン

(無題) 削除/引用 No.10643-14 - 2022/07/24 (日) 09:59:26 - おお >[Re:13] xcvghさんは書きました : > チューブ式の遠心濃縮（タンパク質用低吸着遠心フィルター）が簡便ですが、 コロジオンアミコンという会社があったけどミリポアに吸収された（？）のでミリポアの製品として売っていますね。商品名にはアミコンの名前がまだあるかな？ コロジオン膜をつかってサンプルを入れたBagの外を陰圧にさらして水を除くとか言うのもあるみたいだし、同じようなやり方ができるとしてピアスのセルロース膜（スネークスキンとかいう名前だったかな）の売り込みをやってたみたい。 もっと大胆なやり方は透析チューブにサンプル入れて封して、コールドルームで干して置くっていうのを聞いたことがある。 ただ、実際方法論として生化学の本などでみるのは、透析膜にサンプルを入れて封をしたものに粉末のPEGをかけるとPEGの分子量が適切であればPEGが中に入れないので浸透圧の差で水分が外に出てきて濃縮ができるというやつ。一度やったけどそれでもなにかバックの中に入っているようでサンプルが沈殿したことがある。WBで変性してもいいならデタージェントなどで沈殿を避けることはできるとはおもう。

(無題) 削除/引用 No.10643-13 - 2022/07/21 (木) 15:01:32 - xcvgh チューブ式の遠心濃縮（タンパク質用低吸着遠心フィルター）が簡便ですが、タンパク質によっては吸着ロスも無視できないので完璧とは言いきれません（いくつかバージョンがあり分画分子量が違うので注意。またこの分子量もおおよその目安ですので、ある程度余裕持って選定したほうがいいです）。amazonとか通販でも売ってます。一番ロスなく確実に回収できるのはスピードバックコンセントレータあるいは凍結乾燥かなあと思いますが、どちらもそのための機器がないことにはできません。生物活性を保持したまま濃縮したいということならば凍結乾燥と思いますがウェスタンならなんでもいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.10643-12 - 2022/07/21 (木) 13:22:09 - マリモ >[Re:2] おおさんは書きました : > 一番わかり易いやり方は凍結乾燥。 > > もっと乱暴なのは９０度（もっと低くてもいいけど）ぐらいのヒートブロックに蓋を開けて放置。熱変性で沈殿しないようにデタージェントとか入れておく必要があるかもしれない。 ふと思ったのですが単純にタンパク質を冷凍保存するとき、あるいはオンアイスにしたときにふたを開けっぱなしにしたら水分だけ飛びませんかね？あまりよくないでしょうか

(無題) 削除/引用 No.10643-11 - 2022/07/21 (木) 12:12:59 - み 要は質問文からは何の実験をやっているのやら、適切な方法を用いているのかも全く分からない。そんな状況でまともなアドバイスは得にくいのでツッコまれるわけで、退散せずに状況を詳しく記載すれば良い。 違うスレでも書いたけど最近多いですね。この手の人。

(無題) 削除/引用 No.10643-10 - 2022/07/21 (木) 11:50:55 - おお EDTAで抽出と書かれていたのでEDTAを使って金属イオンを奪うことで放出されるようなたんぱくを調べていて、回収できるタンパク量は必然的に少ないような実験かと思ったのですが、違うんでしょうか。下流の分析に差し支えないような濃度にするように改善できるならそれはそちらのほうがいいでしょう。ステップが増えるほどブレとかそれぞれのステップでの最適条件とかどんどん複雑になってくるでしょうから。 あと濃度が低かったといいますが、定量はできてますか？ たとえば細胞のTotal lysateで１つのLaneにつき２、３ugも流せばWBで大抵のたんぱくは検出できたりします。

(無題) 削除/引用 No.10643-9 - 2022/07/21 (木) 11:23:09 - zam > 基本的に無いということですね。 いいえ。いくらでもやりようはあると皆さん述べておられますよ。

(無題) 削除/引用 No.10643-8 - 2022/07/21 (木) 09:19:01 - おぉ ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.10643-7 - 2022/07/21 (木) 09:13:37 - おぉ なるほど基本的に無いということですね。 残念ですがやり直しです。

(無題) 削除/引用 No.10643-6 - 2022/07/21 (木) 08:53:59 - iiii Protein Concentratorという遠心で濃縮できるチューブを使ったことがあります。ナンでしたら新たに作り直した方が早いという場合もあると思います。

(無題) 削除/引用 No.10643-5 - 2022/07/21 (木) 07:45:31 - み 何の細胞か知りませんが、EDTAのみで蛋白抽出するプロトコールを見聞きしたことがありません。 EDTAの他に何か入れていないなら細胞からの抽出が上手くいっていない可能性が高いと思います。 buffer組成や細胞破砕方法を詳しく記載すべきです。 また細胞数とbuffer volumeも不明なので抽出されていたとしても薄くて当たり前なのかもしれません。 濃縮方法うんぬんを考える以前の話のように思いますが？

(無題) 削除/引用 No.10643-4 - 2022/07/21 (木) 07:30:28 - momo 高価だけどStrataClean Resinで濃縮。 https://www.chem-agilent.com/contents.php?id=300375 https://www.glycoforum.gr.jp/article/23A15J.html

(無題) 削除/引用 No.10643-3 - 2022/07/21 (木) 06:33:43 - おぉ ウエスタンブロッティングです

(無題) 削除/引用 No.10643-2 - 2022/07/21 (木) 05:43:41 - おお 濃縮したあと何に使うかにもよるかもしれませんので色々あるけどどう答えたらいいものか、、、 一番わかり易いやり方は凍結乾燥。 もしターゲットのたんぱくだけ回収できればいいのならImmunoprecipitation 限外濾過膜で濃縮 スピードバックのようなものでも濃縮はできるが、温度管理をどうするか。温度が室温以上とかだとプロテアーゼもアクティブになる可能性もあるし、変性させてからとするなら下流の実験に適しているのか。 もっと乱暴なのは９０度（もっと低くてもいいけど）ぐらいのヒートブロックに蓋を開けて放置。熱変性で沈殿しないようにデタージェントとか入れておく必要があるかもしれない。 有機溶媒による沈殿（タンパク量が少ないと果たしてうまくいくか、また大抵のたんぱくが変性してしまうがアセトンの沈殿物から活性のあるたんぱくを精製という例はある）。 プラクティカルなことを中心に書いてある生化学のほんなどには一連のことが書いているはず。そういう知識がないのにいきなりここで回答を得ても果たしてその方法があなたの実験にあった方法か判断できるのだろうか。。。

タンパク質濃度 削除/引用 No.10643-1 - 2022/07/21 (木) 04:10:05 - おぉ 細胞から抽出したたんぱく質をいくつかのチューブにわけた後に濃度を計測しました所、濃度が非常に薄かったため、困っています。 抽出はＥＤＴＡで行いました。 同じ細胞に同じ処理を施しているので、１つのチューブに合わせてタンパクを濃縮できれば、解決できると思うのですが、濃縮する方法がわかりません。 どなたかご存知のかた教えていただけないでしょうか？

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