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(無題) 削除/引用 No.10639-12 - 2022/07/21 (木) 00:31:01 - bんkl 細胞はなんでしょうか?（動物細胞、植物細胞、酵母、組織ーーーーー） 細胞破砕の際の溶液はどんなものでしょうか? 細胞破砕の方法はどのようにされていますか？ 遠心条件はどのようなものでしょうか（xg, 時間） 目的は今のその条件において不溶性のタンパク質を得たいということでしょうか。 もしそうならばそのタンパク質は変性しても構いませんか（ウェスタン用、動物への免疫用など）。それとも生物活性等を維持した状態を望みますか（酵素活性が必要だったり機能的実験への使用）。 もし特定の分子を調べたいというならば、今の条件では目指すタンパク質は溶けないとうことは確かですか。 ある条件において不溶性のもの、という言い方しかできません、つまりある場合には可溶性になったり、またある場合には不溶性だったりするということです。ですので不溶性画分を高収率で得るための方策を知りたいならば、そうした条件を可能な範囲で開示した方が良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.10639-11 - 2022/07/20 (水) 19:53:04 - あの それは本当に不溶性のタンパクですか？ 溶解度の濃度による違いは意識していますか？ つまり サンプルが少ない時は、そのタンパクも少ないので、 溶解しているということは無いですか？

(無題) 削除/引用 No.10639-10 - 2022/07/20 (水) 17:44:17 - Kent 多くのご意見ありがとうございます。 サンプルは細胞破砕液ですが、遠心して不溶性のタンパク質を取り出したいと思っていました。 初めのタンパク量が比較的あれば、遠心後に白い沈殿として取り出せたのですが、サンプル量が十分でないときには、非常に小さなペレットとして、上清を除く際に簡単に吸い上げられてしまいます。 これにアガロースなど入れていればある程度防げるのではと考えていました。 説明不足で大変すみません。 皆様のご意見を参考にさせていただきます。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.10639-9 - 2022/07/20 (水) 16:36:24 - noname タンパク質のその後の用途がよくわからないので答えにくいですが、 可溶性画分に行くのであれば陰イオン交換樹脂などにbindさせて精製するのもようのではないでしょうか？ 落としたいのであれば硫安とか。。。

(無題) 削除/引用 No.10639-8 - 2022/07/20 (水) 12:36:26 - bん 細胞の破砕の方法にもよると思います。超音波処理等だと細胞が微細なベジクル状になってしまいたいへん沈殿しにくくなります。当然ですが界面活性剤等があれば溶けてしまい、沈殿するものは溶けなかったものだけになります。一般的には細胞の場合はダンス型ホモジナイザー（ガラス製の手動のホモジナイザー）が使われます。

(無題) 削除/引用 No.10639-7 - 2022/07/20 (水) 12:00:54 - 774R >沈殿画分が微量でロスが生じています。 それは本来、沈殿するべきタンパク質なのですか？　だとしたら沈殿を回収するときにロスが生じたと判断した理由が分かりません。 それとも、本来、可溶性のタンパク質を何らかの方法で沈殿させたいという意味でしょうか？だとしたら、不可逆的で構わないならTCAやアセトン、あるいは硫安分画などがありますが。 >DNAのエタ沈の際のGlycogenに相当するもの GlycogenはDNAが薄すぎてエタ沈時に析出するのに必要な濃度が足りない時にキャリアーを入れると析出しやすくなる仕組みと理解しています。タンパク質でそれをやるなら、タンパク質の沈殿とは事情が違うような気がします。

(無題) 削除/引用 No.10639-6 - 2022/07/20 (水) 11:54:26 - 散々 再沈殿法を理解されていないようです。 DNAを沈殿させて回収する方法は、目的物であるDNAにとっては貧溶媒であり、不純物にとっては良溶媒である溶媒（選択溶媒という）であるところのアルコールを使って分別再沈しているのです。 あなたが実施しようとしているタンパク質の遠心は、単に遠心機を使って比重で分けようとしているのではないですか？

(無題) 削除/引用 No.10639-5 - 2022/07/20 (水) 09:33:00 - おお >[Re:4] あのさんは書きました : > 細胞破砕物を遠心して、沈殿側を採取したいということは、 > 細胞外マトリックスか、膜タンパクですか？ > > それとも、コールドアセトンとか使った後の沈殿ですか？ >[Re:3] momoさんは書きました : > はっきりと書かれてはいませんが、TCA沈殿やアセトン沈殿のような「変性してもいいから沈殿させたい」方法の話ですか？ あ、そうか分画と書いているので総蛋白を沈澱させて濃縮しようとしているわけではないみたいですね。。。 遠心で沈めることができるくらいのたんぱく集合体であれば、たんぱくに親和性の低いCellulose acetateみたいな材質の膜を通してトラップすることはできます。そこからリカバリーもできると思いますが、非変性状態でどうなのかなど詳しいことはわかりません。

(無題) 削除/引用 No.10639-4 - 2022/07/20 (水) 07:52:27 - あの 細胞破砕物を遠心して、沈殿側を採取したいということは、 細胞外マトリックスか、膜タンパクですか？ それとも、コールドアセトンとか使った後の沈殿ですか？

(無題) 削除/引用 No.10639-3 - 2022/07/20 (水) 07:24:49 - momo はっきりと書かれてはいませんが、TCA沈殿やアセトン沈殿のような「変性してもいいから沈殿させたい」方法の話ですか？

(無題) 削除/引用 No.10639-2 - 2022/07/20 (水) 04:36:55 - おお アガロースやセファロースが使えるか私はわかりませんが、たんぱくの沈殿ですからたんぱくを加えるという手法があります。 https://research.fredhutch.org/content/dam/stripe/hahn/methods/biochem/TCA%20protein%20precipitation.pdf たんぱくを加えるのはどうよという意見もあるかと思いますし、私もそう思います。なので他にあるかといえば、たとえば cshprotocols.cshlp.org/content/2006/1/pdb.prot4258 Deoxycholateは酸性では溶けないのでTCAと組み合わせるという手法もあるようです。酸性にふるならアセトンでも行けそうな気がします。 arxiv.org/ftp/q-bio/papers/0703/0703006.pdf こちらではlauroylsarcosinateを使った方法も試してますね。

タンパク質沈殿の共沈キャリアー 削除/引用 No.10639-1 - 2022/07/20 (水) 03:11:25 - Kent 現在細胞の破砕液を遠心分離で分画しているのですが、沈殿画分が微量でロスが生じています。DNAのエタ沈の際のGlycogenに相当するものがタンパク質であれば教えてほしいです。IPの時のアガロースやセファロースは使えそうですが、ほかに経験があるものがあればぜひ知りたいです。よろしくお願いします。

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