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(無題) 削除/引用 No.10633-5 - 2022/08/02 (火) 10:51:51 - mont １０年以上前の経験で、記憶が不確かなのですが、、、 ４％PFAで固定した後に、胎仔の後頭部、脳室に繋がる壁の薄い部分にピンセットなどで小さな穴を開けてから、15％Sucrose/PBSで数時間（胎仔が沈むまで）、30％Sucrose/PBSで数時間（胎仔が沈むまで）で上手くいっていたと思います。 脳室が完全に閉じた状態で急速に脱水すると、脳室を保持する壁が薄すぎて、頭が潰れてしまうのだと理解していました。要は、ご自分の観察したい場所から離れた場所に脳室に通じる穴を開けてから、脱水すればよい、、、ということです。 E9-10ぐらいが、脱水すると頭が潰れやすかった記憶があります。E14-15は穴を開けなくても大丈夫な気がしますが、覚えておりません。

(無題) 削除/引用 No.10633-4 - 2022/07/21 (木) 20:13:06 - あふ ５年前まで胎児脳の、特に海馬周辺を見たくて凍結切片をよく作っていました。 私のやり方は、 母体肝臓に切開、心臓から一気に還流固定（これで多少胎児側も固定される） 胎児脳を摘出 　このときに脳を圧さないように気をつける、私は小脳は必要なかったので、小脳側から眼科用のハサミを入れて、正中に割をいれ、極細のピンセットで頭蓋骨を観音開きにして脳を露出、嗅球側にめくりあげて、そのまま4%PFAの入ったコニカルチューブに落とす 4%PFAでo/nしてから10%スクロース午前中、20%スクロース午後、30%でo/n 　時間が大雑把で申し訳ないですが、朝ラボに到着して、PFAから10%sucへ移して、ランチを食べてから20%sucへ移動させて、帰宅前に30%に入れてました。 とにかく水分量が多い上に、小さい組織なのでやりにくのと、クライオスタットで切るときにも若干変形してしまうので、なかなか難しかった覚えがあります。 参考になりますれば。

(無題) 削除/引用 No.10633-3 - 2022/07/19 (火) 20:08:43 - あの 経験の無い実験ですが、 　　固定する前に既に、脳室が潰れてしまっている という可能性は無いですか？

(無題) 削除/引用 No.10633-2 - 2022/07/19 (火) 18:50:56 - qqq いきなり20% sucroseに浸けるのではなく、10%→20%と段階的に置換してみてはいかがでしょうか。 自分がやっていたのは大分前で浸漬時間の詳細は失念しましたが、10→20→30で行っていた覚えがあります。

マウス胎児脳の脳室がシュリンクする 削除/引用 No.10633-1 - 2022/07/16 (土) 16:59:36 - マウス 初めて書き込みします。 今私はマウスの胎児(E9.5-15.5)のマウスの凍結切片を作製し、免疫染色をしようとしています。 アダルトではこれまでたくさんの経験がありますが、胎児は初めてです。 アダルト同様、マウスを屠殺後、4%PFA固定し、その後PBS洗浄し、20%Sucrose in PBSで一晩4度でcryoprotectionしました。ところが、脳室の間隙が潰れてしまっていました。 これは水が組織から抜けすぎてしまい、脳室が潰れたのではと思います。 胎児脳での脳室に向けての血管新生を見たいがため、どうにな組織が潰れる事なく切片を作製したいです。 胎児脳の免疫染色をされてる方がいましたら、cryprotectionの方法をお聞きしたいです。 よろしくお願いします。

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