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(無題) 削除/引用 No.10630-8 - 2022/07/20 (水) 20:01:52 - yoshi 皆さま、貴重なご助言ありがとうございました。 なかなかうまい方法はないものですね。 繰り返し部分は人工合成し、地道にライゲーションで進めてみます。

(無題) 削除/引用 No.10630-7 - 2022/07/19 (火) 08:39:40 - zam > 繰り返し配列に強い断片の連結法 になるかどうかはわかりませんが、 1. 繰り返し配列単位毎にシームレスクローニングを地道に根気よく3回行う。 2. 繰り返し配列単位のカセットを作り、必要に応じてカセットを精製し、ライゲーションで地道に根気よくクローニングする。 でどうでしょうか。 前者は150merのタンデムリピートならば作製経験があります。私はIn-Fusionでした。数多くコロニーを拾ったので、まあちょっと根気と忍耐が必要でした。 後者は受託会社がよくやる方法です。その際、3つのカセットの末端を変えるなどの工夫をすれば、当りクローンの効率が上がります。 そこはパズルを解くように頭の使いどころです。末端のリン酸化の有無もパズルを解くように考えれば。 ロングオリゴを6本使うので、シームレスクローニングよりもコストが掛かります。 両者とも、当たりクローンのチェックも工夫しどころです。 いずれにしてもちょっと強引であり、かなり泥臭いやり方です。スマートではありません。 配列が違うので同列には比較できませんが、ライゲーションの方がコロニーは多く取れました。当り比率は……覚えていません。 私も割と昔からの人間だからかもしれませんが、ライゲーション推しですね。

(無題) 削除/引用 No.10630-6 - 2022/07/19 (火) 02:10:45 - おお むかしからやっている人間だからかもしれませんが、Ligationでつなげるのが確実のように思ってしまいます。 すでに指摘のあるDirectionが固定できるような工夫ができる制限酵素もありますし、そうでなくとも末端をいじれば繋げれるようにデザインはできますし、ベクターに一つづつ継ぎ足していくという（手間がかかるといえばそうだけど）ある意味確実なやり方もできなくもない。 またこれも指摘がありますが、合成でタンデムにつながったものを作っていしまうのも方法論だとおもいます。ただ私はそういうタンデムな配列がどの程度合成しやすいかなどについてはあまりよく存じておりません。

(無題) 削除/引用 No.10630-5 - 2022/07/18 (月) 17:21:44 - egeria Gap Repairというのが酵母を使った手法のことでしたら、不向きだと思います。酵母の相同組換えは末端でなくても起きるので、Gibson assemblyのようにプライマーをデザインしても、内部のリピート領域で組換えが起きる可能性が高いです。

(無題) 削除/引用 No.10630-4 - 2022/07/18 (月) 10:10:51 - yoshi ありがとうございます。 遺伝子合成は全長が長いので費用と時間もかかりそうですね。 Gap Repairという方法があるようですが、繰り返し配列にも強いのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.10630-3 - 2022/07/17 (日) 13:01:11 - G25 3断片を繋げるのではなく、人工遺伝子合成で一本取りする。

(無題) 削除/引用 No.10630-2 - 2022/07/16 (土) 18:57:42 - egeria BsaIやBsmBIを使うGolden Gate Assemblyはどうでしょうか。NEBのキットのページに書いてあるはずですが、原理的には制限酵素とライゲースによるアセンブリーなので、内部のリピート配列は問題になりません。 慣れるまでプライマー設計がわかりにくいのと、用いる制限酵素のサイトが他の箇所に存在すると面倒なことになるのがネックです。

繰り返し配列の連結 削除/引用 No.10630-1 - 2022/07/16 (土) 11:14:23 - yoshi 200bの繰り返し配列をもつ断片を含む３つの断片をベクターに連結したいと思っています。 Gibson Assemblyを試してみましたがうまくいきませんでした。 繰り返し配列に強い断片の連結法をご存知の方いましたら、ご教示いただければと思います。よろしくお願いいたします。

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