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(無題) 削除/引用 No.10627-4 - 2022/07/16 (土) 00:46:43 - おお クロロフォルム、エタ沈が簡単で特に特別なものを用意する必要もなくできる手段だと思います。１００ulほどのTEとか水を加えて、２０ul のクロロフォルムを加えてよく撹拌して、遠心後、水層をとり、塩（酢酸ナトリウムだと３００mM、NaClなら１５０mMなど）をくわえて、イソプロパノール同量か、エタノール２倍量をまぜ遠心して沈殿を７０％エタノールで洗い、更に遠心後、ペレットを風乾して、水などでリカバーしてください。ng程度の量でも十分回収できます。 わざとクロロフォルムの量を少なくするのは水層を回収しやすくするためです。一旦精製したようなものであればこのくらいで十分です。 エタ沈だけでもかなりのぞけるとはおもうけどね。でも初回のエタ沈でも残っているという感触は私もあるのでエタ沈だけではちょっと気持ち心もとないです。 でもグリコーゲン入れても見えてないのは、、、なんだろうね。

(無題) 削除/引用 No.10627-3 - 2022/07/15 (金) 18:41:42 - qqq 残存フェノール自体はあっても、次の反応に持ち込まれるのは微々たるものだから、そのまま実験を進めて問題なければそれでいいと思います。 駄目ならサンプリング・抽出からやり直す。 Nano Dropの波形は気にしなさすぎるのはアレだが、気にしすぎても仕方ない。

(無題) 削除/引用 No.10627-2 - 2022/07/15 (金) 18:37:26 - G25 >培養細胞からフェノール、クロロホルム、イソプロパノールを用いてRNA抽出を行い、 いわゆるAGPC法ですよね？ フェノール抽出→クロロフォルム抽出→IPA沈殿ということじゃなくて、 >nano-dropの結果、フェノール等の有機溶媒が残存しているような波形となりました。 吸光度から実際になにが夾雑してるかは確定できませんが本当にフェノールだとして、 1) アルコール沈殿(EtOH, IPA)で十分に取り除けます。スタンダードなアルコール沈殿をしてみましょう（NaOAcなどの塩を加えるのを忘れずに。EtOHの場合、DNAでは２ vol. が標準的ですけどRNAには3 vol. が標準的であることにも注意）。 2) ジエチルエーテル抽出。上層の水層をトランスファするCIAA (クロロフォルム／イソアミルアルコール）抽出と違って、上層のエーテルを吸い出して除去するので水層をロスしにくい。残留したエーテルは容易に揮発除去できる。 3) どうせ最後にアルコール沈殿をしなければならないので、バッファーを加えて体積を十分に増やしてCIAA抽出する。

RNA抽出_トラブルシュート 削除/引用 No.10627-1 - 2022/07/15 (金) 17:53:20 - saibou RNA抽出のトラブルシュートに関してです。 培養細胞からフェノール、クロロホルム、イソプロパノールを用いてRNA抽出を行い、6 µlのDEPC水に溶かしました。 （RNA量が少ないのか、グリコーゲンを添加しましたが、沈殿は見えませんでした。） nano-dropの結果、フェノール等の有機溶媒が残存しているような波形となりました。 この状態から、フェノールを取り除くことは出来ますでしょうか。 クロロホルムやイソプロパノールの過程からやり直すことを当初考えましたが、現在のRNAが溶けている溶液の液量が5 µlのため、水層をとったりするのは厳しいのではないかと考えました。 もしご存じの方がおられたら教えていただけないでしょうか。 よろしくお願いいたします。

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