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(無題) 削除/引用 No.10620-25 - 2022/07/16 (土) 01:03:35 - おお うちのPVDFはRocheのやつだなぁ。０.２２の方。0.45umと比べたことはないけど、むかし使ってたNitrocelluloseのときに比べて感覚的には同等以上はあると思っている。

(無題) 削除/引用 No.10620-24 - 2022/07/14 (木) 17:06:03 - lipid zamさん 家庭用については、その通りですよね。 実際、どれ程なのかは、わかりかねる所ですが、、、、。 何か、下段にお書きになられたようなトラップがあったのかもしれませんね。 qqさん 元々はImmobilon-PSQをよく使っていたのですが、価格に負けて別の物を使用していました。ただ、それも当初は問題が無く使用していましたが、イマイチしっくりこなかったのもあります。 また、PVDF膜でシグナルに差異がある情報は、知りませんでした。 とても参考になります。 ちょうどPVDF膜が切れたので、新たに別の物を買いなおしている所ですが、 それを使用してシグナルが戻れば何よりですね。 皆様方、ご回答下さりありがとうございました

(無題) 削除/引用 No.10620-23 - 2022/07/14 (木) 15:28:22 - qq PVDF膜はo.22umの商品を使っているとのことですが、 私はImmobilon-P(これは0.45um)をウェスタンに使っています。Immobilon-PSQ（これは0.22umでシークエンス・MS用）でウェスタンをやってみると、タンパクはきれいに転写できているのに、ウェスタンのシグナルが劇的に低下した経験があります。そこで、ウェスタンにはImmobilon-Pを使っています。 まあ、Immo-PとImmo-PSQの違いの原因はポアサイズとは関係ないのかもしれません。 このあたりの製品が昔使っていたものと変わっている可能性はないでしょうかね？

(無題) 削除/引用 No.10620-22 - 2022/07/14 (木) 14:24:29 - zam > 抗体はポリクロ（rabbit）です。 ポリクロはかなり安定的ですので2〜8℃保存で半年後に急激に落ちることはないように思います。 > 家庭用冷蔵冷凍庫での保管の場合 物にもよりますが、家庭用冷蔵庫は庫内温度のばらつきや温度変化が大きいと思います。 そうであっても、仮に庫内温度が上振れするような冷蔵庫で保存したとしても、ポリクロならば半年間は問題ないと思います（保証の限りではありませんが）。 霜取り機能付きの冷凍庫で凍結保存した場合には、凍結融解の恐れがありますので注意が必要です（これも一般論でしかありません）。 ウェスタンのトラブルの原因はおそらくは抗体ではないように思いつつ書いておりますが、ひょっとしたら、他の実験者がその抗体を雑に扱ってダメにしたりとか、冷蔵庫や冷凍庫をいい加減に扱っているなど、人為的な原因の可能性も調べてみてはいかがでしょうか。 質問者様の知らないところで、他の実験者が抗体を実験台に置きっぱなしにしたとか、37℃のインキュベーターに一昼夜入れちゃったとか、ボルテックスかけちゃったとか、頻繁に凍結融解を繰り返しているとか、疑い出すと切りがありませんけれども。

(無題) 削除/引用 No.10620-20 - 2022/07/14 (木) 13:16:07 - lipid zamさん ご返答、ありがとうございます。 1.市販の抗体です。検出不能（著しい減弱）になる前はきれいに検出出来ていたので、そもそもの抗体は問題が無かったと考えています。ただ、再調達のロットまで考慮してなかったので、この点の不良がある可能性は問題の可能性はありますね。 安かろう悪かろうで悪評高いメーカーの抗体は、余程そこにしかない以外は購入しておらず、今回の抗体もそこではありません。６−７満程度の抗体です。 2.　１の通り、ハイブリドーマから自家調製ではありません。 3.　抗体はポリクロ（rabbit）です。 4. 2〜8℃で溶液状態で保存での抗体の安定性は、ものによるでしょうがそこまで不安定ですか？ 5.　酵素標識した二次抗体の凍結融解は致しません。 　　ちなみに、ラボの冷蔵冷凍庫でなく、家庭用冷蔵冷凍庫での保管の場合、抗体保存の安定性は随分変わりますか？

(無題) 削除/引用 No.10620-19 - 2022/07/14 (木) 12:11:47 - zam これまでは転写かケミルミの問題のように受け止めておりましたが、βアクチンのみ検出不能になったご経験がおありだとすれば、本件もそれと同じ原因の可能性も考えられます。 つまり、抗体の製品としての安定性に原因があるのではとも思ったります。 > １次抗体、2次抗体をリフレッシュしても、効果はありませんでした。 この「リフレッシュ」の意味が特定できませんので、とりあえず、以下に思いつくことをつらつら書かせていただきます。 1. まず、市販抗体であるならば、メーカーを疑った方がよいかもしれません。 メーカーによっては、精製法の問題なのか、保存液の問題なのか、QCの問題なのか、保管の問題なのか、何かわかりませんが、同一製品を購入してもロットが違うと反応が悪くなる物もありました。 メーカー名こそ記しませんが、安かろう悪かろうで悪評高いメーカーもあります。 たぶんこの掲示板でも過去に話題になったはずです。 高価でも品質の安定したメーカーの物に変更した方がよろしいと思います。 2. ラボでハイブリドーマから自家調製されたものでしょうか？ その場合は、長期培養（継代）中に、モノクローナル抗体の性状が変化してしまう場合が稀に起こります。 （私が知っているだけでも、数件あります。抗体のcDNAを確認したらCDRだったかどこかに変異が入っていました。この場合、樹立時のセルバンクからハイブリドーマを新たに起こして培養、精製してモノクロを調製しました） 3. モノクロ毎に保存安定性が異なります。 市販品で、かつ、QCをしっかりしているメーカーならば、そこは信頼できると思いますが、そうでないQCがちゃんとしていないメーカーもありますので、いずれにせよ、注意が必要です。 4. 一般に凍結融解はできるだけ避けるべきだとは言われますが、モノクロによっては割と凍結融解に強いものと弱いものもあります。自家調製品の場合は、そこが問題となります。 ポリクロの場合は、プレパレーション間の差は比較的少ないと思いますが。 5. 2〜8℃で溶液状態で保存する場合は、モノクロ、ポリクロとも、抗体のタンパク質としての長期安定性が問題になります。 アジ化ナトリウム0.09%ならば菌類等の発生は問題ないと思います。 6. 言わずもがなですが、酵素標識した二次抗体は凍結融解で劣化します。 以上、失礼を承知で申し上げております。ご容赦ください。 抗体が原因でないことを願いつつ。

(無題) 削除/引用 No.10620-17 - 2022/07/14 (木) 10:21:18 - lipid おおさん 理屈とは逆で矛盾しますよね。 ただ、毎回そうなるわけではなさそうで、 ほぼきれいに転写（CBB染色で総じて移動していると考えられる場合もあり）されていることもあります。 が、結果は同じでした。 定電流で行っていますが、上述の通り転写は程度良く行ったと思える場合でも、改善はしません。 現状では、唯一ハウスキーピングは検出できますが、以前より結構薄いです。 従前より一桁低いと言いたい位です。

(無題) 削除/引用 No.10620-15 - 2022/07/14 (木) 09:59:36 - おお >転写エラーの確認のため、PVDF転写後ゲルをCBBで染色すると、 >何故か低分子側に行くにつれタンパクの残りが増えますが、 やはりこれはありえないので転写の問題は捨てきれないですね。。。 定電圧か定電流でやっているのかわかりませんが、そのへんは昔と比べて変化ないですか？ 低分子側のほうがたんぱくのポピュレーションが多いので実は全体的に効率よく写ってないけどそう見えるだけなのかも。

(無題) 削除/引用 No.10620-14 - 2022/07/14 (木) 09:28:19 - lipid zamさん ご返答ありがとうございます 1.　プレステインマーカーは、膜にきれいに転写されています（ゲルの方に残っては無さそうな程度の確認ですが）。 2.　PVDF膜のポアサイズは0.22 3.　アジ化ナトリウムの有無（濃度）は、ご指摘の通りHRPに影響するのでこの洗浄等は気を付けて寝にリにしています。抗体中のNaNは0.09ｗ/ｖ％で、それを数千倍以上には希釈され使用します。 4.　二次抗体の動物種は問題ないです。 5.　変わったものは、膜洗浄に使用するＰＢＳ位です。 6.　イメージング機器は全学共同機器使用ですが、他の講座からの故障等のクレームは出ていません。 もう１つ、不思議な事があります。 このトラブル以前のお話ですが、 ある時を境に急にβアクチンのみが検出不能になりました。 この際も速やかに抗体を買いなおしましたが回復せず、 ハウスキーピングを他のものに変えました。 未だに謎です。 βアクチンにしても、抗体が良くてバリバリ検出できていたものが、 ある時を境にもしくは、急激に検出ができなくなると言うトラブルです。 原因が分からず、悩ましい所です。。。

(無題) 削除/引用 No.10620-12 - 2022/07/14 (木) 08:56:23 - zam まだ指摘されていないこととしては…… たとえば、プレステインマーカーを泳動して転写効率をチェックしてはいかがでしょうか。 PVDF膜のポアサイズ、アジ化ナトリウムの有無（濃度）、二次抗体の動物種も要チェックです。 同じ実験者で半年前と操作が違うとは考えにくいですが、ラボで共同購入している試薬類やバッファー等が変わっていたというのは十分あり得ます。 イメージング機器による検出ならば、機器の設定変更や故障も疑ってみては。 写真撮影なら、現像液等のへたりの可能性もあるかと思います。

(無題) 削除/引用 No.10620-11 - 2022/07/14 (木) 01:53:22 - おお >[Re:9] totoさんは書きました : > ケミルミがへたってるかは、ドットブロットで、1次抗体をスポットして、それでHRP2次抗体とincubateして発光を調べることで簡単に確認できます。どれくらい減ってるかは、新品の試薬と比較しないとわからないですが。 1次抗体をスポットするとWBではありえないほどの発光をすると思うのだけど、光っても活性は十分の１ぐらいということはないでしょうか。私もキットの活性とか２次抗体のHRPの活性をモニターできればいいとは思っているのですが、どうもそれでいいのかと思ってしまうのです。 > あと、ケミルミのＢ液はほとんどどこもsodium perborateと思いますが、これは安定な酸化剤で、へたることがあるとはちょっと思えません。キットのはおそらく4mM程度なので、sodium perborateを買って作って4度でおけば、数年使えます。 carbamide peroxideやsodium perborateが安定で使えるというのは知っているし、室温で比較的長い間持つやつはそういうの使っているかなとも思うけど（明示されていないからわからないけども）、でも一年も持つっていう感覚はないです。

(無題) 削除/引用 No.10620-10 - 2022/07/13 (水) 18:40:04 - lipid totoさん ドットは、抗体パネルでって思ってて、まだしてませんでした。 これが一番直接的ですね。 ASPでやってみます。

(無題) 削除/引用 No.10620-9 - 2022/07/13 (水) 10:12:15 - toto ケミルミがへたってるかは、ドットブロットで、1次抗体をスポットして、それでHRP2次抗体とincubateして発光を調べることで簡単に確認できます。どれくらい減ってるかは、新品の試薬と比較しないとわからないですが。 あと、ケミルミのＢ液はほとんどどこもsodium perborateと思いますが、これは安定な酸化剤で、へたることがあるとはちょっと思えません。キットのはおそらく4mM程度なので、sodium perborateを買って作って4度でおけば、数年使えます。

(無題) 削除/引用 No.10620-8 - 2022/07/13 (水) 07:24:46 - lipid 皆々様、ご回答ありがとうございます。 まとめて、返答いたします。 まず、情報漏れですが、乾式で行っております。 転写の不均一のご指摘は、確かにあると思います。 機器を変えて検討した所、均一に転写はされる （CBB染色での確認で、ゲルに残るバンドが全体に均一に薄くなる） ものの、やはり検出ができませんでした。 メタの濃度を落とす（20-10％）に落とすなどでも、 転写効率については検討しています。 CBBだけでなく転写後のメンブレンの染色も同時に行っていますが、 感度の違いもあり濃いバンドの転写は確認できますが、 CBBで薄めのバンドはポンソでは確認不能でした。 ただ、濃いバンドが転写されているので、まあまあ大丈夫かなと考えています。

(無題) 削除/引用 No.10620-7 - 2022/07/13 (水) 06:38:46 - おお >[Re:6] iiiiさんは書きました : > 転写するときのスポンジがヘタってませんか？新しい厚みのあるスポンジに切り替えたらうまくいったことがあります。 スポンジは２つ考え方があって、ちゃんとずれない程度にサポートするのに十分なあつさがあればいいとする考え方。この場合はメタノールを含むTransfer buffer中で縮むので、まずTransfer Bufferにゲルをいれてゲルが縮んでからセットするみたい。 もう一つはある程度の厚さでしっかりとゲルを押さえ込んで、Transfer buffer中でゲルが縮んでTransferの最中にズレてくるのを防ぐ方法。 いずれにしろある程度の厚みがいる。またスポンジの目が詰まってくるのももしかしたらうまくいかなくなる原因になるかもしれないが、良くはわからない。まあそんなに詰まってくると流れる電流とかも変わってくるだろうから気が付きそうな気もするが。

(無題) 削除/引用 No.10620-6 - 2022/07/13 (水) 00:35:44 - iiii 転写するときのスポンジがヘタってませんか？新しい厚みのあるスポンジに切り替えたらうまくいったことがあります。

(無題) 削除/引用 No.10620-5 - 2022/07/12 (火) 23:29:25 - LPS 転写も均一にいってないような気がします。コンタクトが均一じゃない可能性があります。ケミルミが疑わしいですが、ベターウエスタンのために、ちょっと調べたほうがいいかもと思いました。蛇足ながら

(無題) 削除/引用 No.10620-4 - 2022/07/12 (火) 23:09:18 - おお ケミルミは短いもので使用期限が２ヶ月くらい、H2O2の代替えなどのケミカルを使った長期保存できるものでも確か６ヶ月とか。お手元のものがどれに当たり、どれくらい持つものか確認してください。使えなくなったら、H2O2をたして使う人もいるにはいるとおもう。 あとPVDFの方は Ponceuとかで染めて確認することもやったほうがいいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.10620-3 - 2022/07/12 (火) 20:53:08 - lipid G25さん ご回答有難う御座います。 ありがちですかー。。。 書い直すのが近道ですかね〜、やはり。 取り急ぎ、サンプルもらって試してみます。

(無題) 削除/引用 No.10620-2 - 2022/07/12 (火) 18:07:40 - G25 >残りのケミルミのヘタリの可能性もあるかもですが、 あり得るし、ありがち

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