BioTechnicalフォーラム [PCRでtotal RNAの濃度差による差ができない…]

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(無題)

No.1062-15 - 2012/10/27 (土) 03:07:03 - おお

あとエチブロでバンドを検出しているなら、バンドが飽和してしまってきれいに定量できてない可能性も考えた方がいいかと。

(無題)

No.1062-14 - 2012/10/27 (土) 03:04:46 - おお

>[Re:10] Troubled+Chemieさんは書きました :
> > 最低でも、1µぐらいはアップライしたいですね。
> 1μLも一応やってみましたが残念ながら同じ結果でした。
>
0.25と1で差が見られないなら感覚的に増幅が飽和しているのではと、、、すでに指摘にありますように、サイクル数を徐々に下げた方がいいでしょう。

想像だけでかきますが、条件を厳しくしてやって増幅効率を落としてやるといいかもとおもいましたが、、、

たとえば理想的な増幅効率は1サイクルに2倍で、2倍の濃度差は1サイクルで追いついてしまいます。それでさらに飽和してくるとさは見れないともいえるわけで、増殖効率をさげると(アニーリンク温度を高めにせってして、時間を短めにするとか)2倍のさは1サイクルで追いつかなくなります。

どんなもんでしょうか。

(無題)

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No.1062-13 - 2012/10/26 (金) 22:42:34 - おお

経験的には20サイクルでもじゅうぶん増えているので

遅いというと？

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No.1062-12 - 2012/10/26 (金) 21:20:47 - Troubled Chemie

> アクチンで29サイクルは感覚的にちょっと遅い気がしますけど、、、もちろん条件によって大きく変わるかもしれませんけど、、、

遅いという表現をされていますが、どういう意味でしょうか。

(無題)

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No.1062-11 - 2012/10/26 (金) 18:53:56 - AP

>cDNAを順次オートクレーヴ済蒸留水で10倍に希釈してまずは行ってみたいと思います。

過去にも話題になりましたが（たぶん古い板）、吸着ロスに留意する必要があります。濃度が下がるほど、吸着のインパクトが大きくなるので、上手くやらないとリニアリティがでません。蒸留水ではなく、適当なキャリア入りの溶媒（tRNAやlinear polyacrylamideなど）で希釈するのが吉です。

ご返答ありがとうございます

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No.1062-10 - 2012/10/26 (金) 17:39:42 - Troubled+Chemie

> 最低でも、1µぐらいはアップライしたいですね。
1μLも一応やってみましたが残念ながら同じ結果でした。

> まずは10倍くらいの希釈系列を数段階作って、2サイクルごとに増幅を見てみてはいかがでしょうか。
参考になりました。10倍を作り27及び29サイクルなどでみてみます。（既に見えているので29サイクルから下げる方向で検討してみます)

> そもそも、定量的な希釈列をつくろうとしたら、可変ピペットのダイヤルで体積を振るなんてそもそもご法度ですよね。正式な作法で希釈列を作ってやってください。
cDNAを順次オートクレーヴ済蒸留水で10倍に希釈してまずは行ってみたいと思います。

> ・テンプレートに使用したcDNA量をRNA量で示すこと。
逆転写に用いたtotal RNAは4912 ng/μLでoligo dTプライマーを用いて逆転写を行いました。

> ・その増幅したサンプルのバンドのサイズは予想されるサイズですか？
100bpのラダー付近に存在していたのでampliconとしては104程度とみなしてよいと考えられます。

> ・そのプライマーは特異的にcDNAテンプレートのみで増幅するものですか？
cDNA自体が混合物であるので何とも言えませんが、少なくとも目的の物以外を増やす傾向はみられておりません。

> ・cDNAサンプルにおいてgDNAのコンタミはありますか？
gDNAのコンタミに関してはカラムを通しているためないと考えております。

(無題)

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No.1062-9 - 2012/10/26 (金) 15:44:23 - 通りすがり

最低でも、1µぐらいはアップライしたいですね。

(無題)

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No.1062-8 - 2012/10/26 (金) 15:19:35 - ~

まずは10倍くらいの希釈系列を数段階作って、2サイクルごとに増幅を見てみてはいかがでしょうか。

2.5倍希釈の2サンプルで、サイクルが1箇所だけというのは、事前に予備実験をして決めたのでない限りは、狭すぎる範囲だと思います。

(無題)

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No.1062-7 - 2012/10/26 (金) 14:56:51 - TS

わたしも0.2と0.5μLをちゃんと測れてない、に一票。

(無題)

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No.1062-6 - 2012/10/26 (金) 14:54:04 - AP

>0.2μL cDNAを用いた場合も0.5μLを用いた場合も同じようなスポットが電気泳動の結果出るのみです

これは微妙すぎではないですか？　cDNAを希釈してもっと量りとる体積を大きくするとかしないと、チップの中に残ったり外側に付着したりする体積や、手ぶれなどによる狂いで、両者の差なんか軽く越えてしまうでしょう。

そもそも、定量的な希釈列をつくろうとしたら、可変ピペットのダイヤルで体積を振るなんてそもそもご法度ですよね。正式な作法で希釈列を作ってやってください。

(無題)

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No.1062-4 - 2012/10/26 (金) 13:10:53 - おお

アクチンで29サイクルは感覚的にちょっと遅い気がしますけど、、、もちろん条件によって大きく変わるかもしれませんけど、、、

(無題)

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No.1062-3 - 2012/10/26 (金) 12:59:37 - 7744

まず、
・テンプレートに使用したcDNA量をRNA量で示すこと。

次に、
・その増幅したサンプルのバンドのサイズは予想されるサイズですか？
・そのプライマーは特異的にcDNAテンプレートのみで増幅するものですか？
・cDNAサンプルにおいてgDNAのコンタミはありますか？

(無題)

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No.1062-2 - 2012/10/26 (金) 12:55:50 - おお

エチブロで見える程度に増えたころにはもう頭打ちになっていると一般的に言われているかと、、、

PCRでtotal RNAの濃度差による差ができない…

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No.1062-1 - 2012/10/26 (金) 12:47:14 - Troubled Chemie

現在PCRでマウス全脳から抽出したtotal RNAを用いたPCRでβ-actinの一部を増幅しておりますが、29cycleを経ても0.2μL cDNAを用いた場合も0.5μLを用いた場合も同じようなスポットが電気泳動の結果出るのみです。

既に頭打ちしているのかと思い25cycleに下げた結果全く見えなくなったのですが、このような場合どのように解決すべきでしょうか。

サンプルは両方とも脳を摘出した後すぐに液体窒素で凍結し、破砕した後にTRIzol Reagentを用いて溶解しクロロホルムにより上層を採取した後にイソプロ沈と75%エタでのリンスをしております。

A260/280は1.91が出ております。

PCR環境はBlend Taqを用いており、ampliconは104です。

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