全34件 ( 1 〜 20 )　 前 | 次 　1/ 1. 2. /2

長っ 削除/引用 No.1062-35 - 2012/10/31 (水) 10:29:27 - ~ >real-time PCRを行う以前の様々な確認及び適正条件の把握が目的です。 様々な確認を行うことが目的であり、かつ実験がうまくいっていないのですから、 様々なステップについて確認を行いたいのですよね？ 制限があってできない確認法(シークエンシング、gDNA Removerの使用)については、安い代替法を調べて行いましょう。 それがなければ、実験のために必要な費用であることをボスに説明し、実施の許可をもらいましょう。 >real-time PCRは通常のPCR操作である程度のことが出来ないと無理だと念を押されている 今回のトラブルについて各ステップで問題の有り無しを調べて対応できれば、 real-time PCRでトラブルが起きても解決できるとアピールできるでしょう。 >gDNA Removerは使っておりません。経費的な問題で現状不可とされました。 今の時点では、ゲノムDNAがコンタミしているのか分からないのに、念のためで金を使えないという意味ではないでしょうか？ ゲノムDNAの混入のデータを示しても駄目といわれるのであれば、RNA回収ステップで頑張るしかないでしょう。 �@プライマー配列とゲノム配列のアライメントを行っておらず、何を増やしているのかは論文情報任せ 配列を読まなくても、（他の系統の）ゲノム情報から予想されるバンドのサイズと、制限酵素地図は調べられますよね。 そこまではネットにつながる環境であればコストは無視できるでしょう。 系統が異なるといっても、イントロンの有り無しまで異なることはあまりないと思いますし、複数の制限酵素認識サイトの塩基配列が同時に変わっていることも少ないでしょう。 制限酵素処理は金がかかりますが、DNA polymeraseよりも安いはずです。 何が増えているか分からないPCRを繰り返して金を使うよりも、確認のために金を使った方がいいのではないでしょうか。 �AゲノムDNAの残存は電気泳動でEtBr染色で見えないレベルであることまでしか確認していない もともと見えないくらい微量なDNAも増殖できるのがPCRですよね。 RTで作ったcDNAも、泳動してEtBr染色しても、バンドとしてはほとんど見えていないのではないでしょうか。 既に指摘されていますがRT-でのPCRが一番簡単で安いかと思います。 �Bサイクル数は1回の実験で1~2点しか見ていない 毎回同じ増幅効率であることはまだ確認できていないようですよね？ 確認できていないのでしたら、異なる増幅効率で増えるサンプルをそれぞれ異なるサイクル数で評価することとなり、繰り返しても最適なサイクル数は得られません。 半定量PCRであれば、1つのチューブで2サイクル程度ごとに少量を抜き取り、同時に泳動して評価している論文を見つけられるはずです。 そのやり方であれば、1〜数回の実験でおおよその立ち上がるサイクル数を見つけられるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.1062-34 - 2012/10/31 (水) 00:26:00 - おお >[Re:28] Troubled+Chemieさんは書きました : > 併し、49℃にアニーリング温度を上げたり、サイクル数を2減らしても増幅産物が現れないどころか、29サイクルで現れていた産物までも消えているというのが… プライマーダイマーをみてたというおちかもしれませんが。。。

(無題) 削除/引用 No.1062-33 - 2012/10/31 (水) 00:15:21 - おお もしどなたかすでにRTをして、昔に使ったサンプルがあるなら、差支えがないていどにいただいて、並行してやってみるのもてです。とりあえずマウス由来ならなんでもいいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.1062-32 - 2012/10/31 (水) 00:12:35 - おお >尚、mRNAからprimerを設計している旨の記述はありましたので、エクソンのみの配列ということになるかと考えております。 >（これも経費などの問題で配列を調べる必要はないというお達しが上から来ており、文献より引用した形式になっております） 文献の記載ミスとか頻度にあります。リバースのプライマーを+鎖の配列で記述してたり3'から5'の順で書いていたり。私の知り合いは論文に書かれている配列をそのまま注文していざPCRというときに間違えている事が分かり、仕方なく買い直したひともいます。 経費の問題というのが理解できないのですが、イントロンをまたいだmRNAの配列をつかっているかどうかで、あなたの今まで見てきた結果の解釈がかわりますし、それに対してのトラブルシューティングもちがってきます。その部分は経費と関係ありますか? PCRなど詳しく説明サジェスチョンもありますが、RNAの精製、評価、RTの反応などすべてにおいてうまくいっているか見えない点がおおいので、回答者も何処をどの様にサジェスチョンすればうまく行くのか悩むところです。まだ、分子生物学的な知識は勉強中なのかもしれませんので、少し知識も追いついていないところもあるようで、回答にたいする反応もすこしぎこちなく思えます。 こういうWEBサイトですので、一から基礎の知識の講義はできませんし、相談はいいのですが、解決する回答に至るにはちょっと遠いようなきがします。リアルタイムのまシーンがあるならよく使っている人もいると思いますし、隣のラボとか近くに詳しい人が居るなら一度データーをそろえて話してみてはどうでしょうか。であなたの上の方と、その人を交えて話をするとか、、、 このまま、ここで、今回こうなりましたとかいわれても解決にはほど遠いきがします。

(無題) 削除/引用 No.1062-31 - 2012/10/30 (火) 22:45:00 - KEN ミス 誤：さらにEtBrではなくSYBR法で検出すればよいかと思います。 正：SYBR Safe等

(無題) 削除/引用 No.1062-30 - 2012/10/30 (火) 22:41:55 - KEN えと、分子生物学のバックグランドのない方かと察しますが、まずは、ここで聞くよりも、Molecular Cloningを読むか、難しければ羊土社の本で勉強なされたほうが、早いかと思います。Figureも多いので、文字で我々の説明を読むよりわかりやすいと思います。 そもそも、内因性コントロールですよね？ いくら、系統が違っても、他の論文にあたれば、実験条件が書いていると思います。プライマー配列を直接Googleで調べましたか？ 私は、シークエンスしろと言っているのではないのですが。。。論文の著者の方は、何らかの配列をもとにプライマーを設計しているわけで、その配列はおそらく入手可能だと思います。 不可能でも似た系統のファイルをダウンロードしてきて、調べればよいだけで。。。数分あれば出来る事なので、身の回りのプライマー設計の経験がある方(この分野の方なら誰でもあるはずですが)に聞くのが良いかと思います。 まあ、シークエンスも数百円で出来るので、あまり値段を気にせずやってしまうことが多いですが、論文引用の場合は、私もすっ飛ばすことが多いです。。。 また、他の方が仰られたRT-の検体で最初のバンドが増えたPCR条件でPCRを行ったらどうなったのですか？ そもそも、バンドの濃度差を見ることに固執し過ぎで、そもそもの実験目的であるリアルタイム前の予備実験ということをお忘れではないでしょうか？ Negative Control: 1. DW, 2. RT-RNA(RT反応していないRNA) positive Control: 3. RT+cDNA 上記3検体をpositive Cont.では、きちんと増幅できる、Negative cont.では増幅されないということ、プライマーダイマーがないということを確認しましたか？ 濃度差云々の前に、適切なPCR条件を決定するほうが、先です。 一般的なリアルタイムのSYBR法の条件は 2step法では 初期変性　95度：30sec ______________x40サイクル 変性：95℃、5秒 アニーリング/伸長反応：60℃、20〜30秒 ＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ 3step法では 初期変性：95℃：30秒 ______________________x40サイクル 変性：95℃、5秒 アニーリング：55℃、30秒 伸長反応：72℃、30秒 ＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ で行います。 あとは多少Modifyすることもありますが、基本はこれです。 これで、きちんと先に挙げたRT反応なしRNAをPCRにかけて、増幅がないことを確認して下さい。 あと、0.5と1の濃度差なんてそもそもリアルタイムを予定しているのに、ゲルのバンドの濃さで見ることに何の意味があるのか、私にはさっぱりわかりません。予算がないとおっしゃられていますが、よっぽど試薬の無駄な気がします。 そんなに見たいならば、RNA濃度の時点で、もっとRNA量に差をつけて逆転写をdTプライマーではなく、増幅に用いるプライマーに変えて1step法で行い、さらにEtBrではなくSYBR法で検出すればよいかと思います。 そもそもの、あなたの0.2と0.5で濃度差を見るというのは、ボスの指示なのですか？ リアルタイムの予備実験をしろという指示なのではないですか？ ならば、もっとやらないといけないことがあるかと思いますが、いかがでしょうか？

実験書を読みましょう 削除/引用 No.1062-29 - 2012/10/30 (火) 19:46:09 - たろう 安易に質問する前に、ちゃんとした実験書を読むべきです。 とりあえずは間に合わせですが以下の文章だけでも読んだ方がよいです。 http://www.takara-bio.co.jp/prt/pdfs/prt3-1.pdf

(無題) 削除/引用 No.1062-28 - 2012/10/30 (火) 19:03:33 - Troubled+Chemie > わたしもせめて、配列をbeta-actinのmRNAの配列にあててご自分のめでたしかめて、くわえてイントロンをまたいでいるかぐらい確認なさった方がいいとおもいます。real-time PCR用とありますが、まさかゲノムDNA用でイントロンに設計されているとかないと思いますが、、、アクチンはbeta-actinのプライマーでしょうかっていうところまで心配しないと行けないような気がしてきましたけど、、、 しかしながらPubmedなどで調べても本系マウスの遺伝子系が載っていないので既存の論文から引用した形です。 尚、mRNAからprimerを設計している旨の記述はありましたので、エクソンのみの配列ということになるかと考えております。 （これも経費などの問題で配列を調べる必要はないというお達しが上から来ており、文献より引用した形式になっております） 併し、49℃にアニーリング温度を上げたり、サイクル数を2減らしても増幅産物が現れないどころか、29サイクルで現れていた産物までも消えているというのが…

(無題) 削除/引用 No.1062-27 - 2012/10/30 (火) 00:36:09 - おお >[Re:26] KENさんは書きました : > >プライマは元々の文献でreal-time PCR用に設計されたものですので、リアルタイム用と考えて問題ないかと思います。 > とのことですが、SYBR用の設計、TaqMan Probe用の設計で、異なってきます。 わたしもせめて、配列をbeta-actinのmRNAの配列にあててご自分のめでたしかめて、くわえてイントロンをまたいでいるかぐらい確認なさった方がいいとおもいます。real-time PCR用とありますが、まさかゲノムDNA用でイントロンに設計されているとかないと思いますが、、、アクチンはbeta-actinのプライマーでしょうかっていうところまで心配しないと行けないような気がしてきましたけど、、、

(無題) 削除/引用 No.1062-26 - 2012/10/29 (月) 23:14:34 - KEN えと、どなたかラボに分子生物学の専門の方はおられないのでしょうか？ ちょっと、その調子で進めると、実験計画自体が危うい気がします。 大学の方でしたら、技術部の方に聞くなりされたほうが良いかと思います。 >プライマは元々の文献でreal-time PCR用に設計されたものですので、リアルタイム用と考えて問題ないかと思います。 とのことですが、SYBR用の設計、TaqMan Probe用の設計で、異なってきます。 また、RT-PCRをする場合、gDNAが含まれていても増幅されないようにイントロンをはさんでプライマーを設計します。(intron spanning assayといいます) まずは、そこのところをきっちり確認する必要があります。仮にintron spanningならば、そこまでgDNAにガチガチに気を使わなくてもよいので。。。 もし、カラム精製レベルでgDNAが消えるなどと先輩がおっしゃられているならば、大間違いです。 そもそも、PCRでは指数対数的に増えるわけで、抽出の段階で大方は除去しているわけですし、PCRする前から泳動で見えるわけがありません。それにgDNAの時点では色々な鎖長の断片があるわけで、非常にうすまるじゃないですか？極微量にgDNAが含まれていたとしても、あなたの使っているプライマーで増幅されるとするならば(intron spanningでないとすると)、要するにPCR反応でgDNAからampliconが増えてきてしまうのです。 ですから、negative controlとして、RT-PCRの時は、RTした検体とRTしていない検体と両方別々のウェルに入れて実験します。両方からバンドが検出されたならば、gDNAが増えていると考えるわけです。 あと、もう一つの可能性としては、コンタミネーションもありえます。試薬が汚染されてしまうとなんでもかんでもバンドが出てくるようになります。 negative controlとして、私は必ず水をサンプルとしてPCR反応を行います。 慣れていても時々、やらかしてしまうミスなので、この点には気をつけて下さい。 あと、gDNA RemoverはTOYOBOのReverTra Aceとセットで売っていますが、値段は、2000円の違いです。リアルタイム2回するとそのくらいの代金はかかってしまうと思いますが、大丈夫でしょうか。 先に挙げた、コンタミは特に試薬がいっきにゴミに化ける瞬間ですので、予算が厳しい時ほど、気をつけて下さい。 gDNA Removerがないとすると、DNase I処理をきっちりやってリアルタイムするしかありません。私は、一晩くらい処理したりしていました。(業者のプロトコール通りですと、高頻度でPCRをした時に逆転写していない検体からampliconが増えてきました。すなわち、gDNAが残っているということです。) RTしていない検体が増えてしまうとリアルタイムのデータ自体がゴミに化けてしまうので、gDNA RemoverはRever Traとセット販売なので、まだ試薬が残っていて、買い直すお金がないない&プライマーが実はgDNAも増える設計というならば、プライマーを買い直すのが早いかと思います。(プライマーは安いですし。。。) あと、カラム精製と仰られていますが、どこのメーカーの製品でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1062-25 - 2012/10/29 (月) 22:15:00 - おお >[Re:24] Troubled+Chemieさんは書きました : > β-actinを取り出すのにマウスの脳ではどれくらいの重量がいるのでしょうか、以前40mg程度の部分で行っていたときは29cyclesでもPCRはできていませんでした。 > 全脳(450mg前後）では出きるようになったのですが、時々出来ないことも有ります（恐らく操作ミスなどで壊れてしまったのかと考えては居ます） http://www.qiagen.com/products/rnastabilizationpurification/rneasysystem/rneasymini.aspx#Tabs=t1 10mgもあれば10ug位は取れると思いますので、それで十分数回のRTができます。 RNAはおそらく壊れたとか不確定なところをつくらず、壊れたかどうか確認してからつかってください。じゃナイトどれがこわれて、どれが壊れてないか分からない状態で実験しても信用できるデーターがとれません。PCRよりもRNAを取るステップのほうが難しいです。 変性させてTAEのアガロールゲルで10分流してエチブロで検出できます。マイクログラムオーダーあれば検出できます。エチブロが嫌ならメチレンブルーでも染色可能です。変性はホルマリン、ホルムアミド存在下でおこないますが、１度プロトコール集などよく見てください。 > > また、20cyclesでも増幅が確認できているとのことでしたが、エチブロを用いた電気泳動で確認できたのですか？ できます。 > gDNAが消えていない…ですか > とは言ってもgDNAと思しきスポットは抽出及びカラムがけ後の電気泳動で見当たらなかったのですが…そのようなレベルで引っかかるのには今一（まだ経験不足故そう思うのかもしれませんが）納得がいかないのです。 ん電気えいどうでみてるんですね。。。RNAをちょくせつ。。。でなぜ壊れたかどうかわからないのか、、、RNAがOKならRTが問題と言う事になるかと。 RNAを電気えいどうしてgDNAのバンドがないからgDNAがコンタミしてないっていうのは判断があまいです。1コピーあればPCRで増幅できます(理想的に)。ゲノムからPCRを行う際に必要なDNA量は10ngクラいで十分で1ngでもおそらくたいていのばあい増幅できるとおもいます。1ngは電気エイどうでは検出できませんよね(きゃピラリーの場合は検出感度がもっといいかもしれませんが、インプットも少ないでしょうから、1ugのRNAにつき1ng程度でもアウトと思ってください)。 ゲノムのコンタミはRT反応を酵素なしでやって、PCRで評価してください。RNAを直接PCRでも評価はできます。

追加でお伺いしたいのですが 削除/引用 No.1062-24 - 2012/10/29 (月) 20:50:06 - Troubled+Chemie β-actinを取り出すのにマウスの脳ではどれくらいの重量がいるのでしょうか、以前40mg程度の部分で行っていたときは29cyclesでもPCRはできていませんでした。 全脳(450mg前後）では出きるようになったのですが、時々出来ないことも有ります（恐らく操作ミスなどで壊れてしまったのかと考えては居ます） また、20cyclesでも増幅が確認できているとのことでしたが、エチブロを用いた電気泳動で確認できたのですか？ 27及び25cyclesで確認できなかったのでその点に関しても少し条件が違うのではないかと考えてみたのですが… また、49℃でのアニーリングでは29回もアウトでした。 そもそもPCRで増幅する段階で問題があるのか、それとも逆転写が上手くいっていないのかすら疑念を抱いてしまうようになってきています。 個人的には逆転写で失敗しているのかと考えてもいるのですが、この場合はmRNAの破壊orプライマーの破壊or酵素の失活が原因かと考えています。

(無題) 削除/引用 No.1062-23 - 2012/10/29 (月) 20:33:11 - Troubled Chemie > TOYOBOのですか？私も使っていますが、gDNA Removerはお使いですか？そうであれば、かなりの高確率でgDNAは消えますが、以前、試したところ、カラムで精製しただけの(この時点で、DNase処理はしていますが。)RNAを多めに入れると、リアルタイムでgDNAが検出されます。(Ct値からすると、おそらくゲル泳動でも見えるレベルだったかと。。。) gDNA Removerは使っておりません。経費的な問題で現状不可とされました。 > また、今回のPCRで使われているプライマーは、リアルタイム用でしょうか？ プライマは元々の文献でreal-time PCR用に設計されたものですので、リアルタイム用と考えて問題ないかと思います。 > 私は、gDNAが消えていないに1票。 gDNAが消えていない…ですか とは言ってもgDNAと思しきスポットは抽出及びカラムがけ後の電気泳動で見当たらなかったのですが…そのようなレベルで引っかかるのには今一（まだ経験不足故そう思うのかもしれませんが）納得がいかないのです。

(無題) 削除/引用 No.1062-22 - 2012/10/29 (月) 15:00:44 - おお 最近RTーのコントロールはみないんでしょうかねぇ。。。ってかいい加減になり過ぎてるんでしょうか、、、 ゲノムはよく確認してほしいですけど、テンプレートを希釈して差が出るかなので基本的にはゲノムが入っていてもさが見れるけいであれば、見れるはず。 でもなぜそんなりリアルタイムPCRで敷居が高くなってるのかふしぎですね。ぴペッティングなどの操作はクリティカルですけど、そんなのスタンダードとか希釈とかやればすぐ精度は分かるはずですし、そもそも電気えいどうでながしてPCRかかっているじゃないですか。 もしゲルで流してほんとに定量したかったら、飽和する前のエチブロでは見えないぐらいの増幅をしておいて(見えるころには飽和している可能性が高いので)、PCRサザンで定量性をかくほするか、RI(HOT_PCR)を使うかでしょうけど。

(無題) 削除/引用 No.1062-21 - 2012/10/29 (月) 13:27:29 - KEN >以前にも書きましたが、使えるプライマーを文献から引っ張ってきたのみですので、そのあたりは不明です。 配列をきちんと確認せずに、そのまま使うのはやめたほうが良いかと思います。。。私は、他の論文からのプライマーを用いる時は、必ず、元となった配列をNCBIのNucleotidesなんかで検索します。ときどき、論文に嘘が書いてあることもあります。(その偶然で、たまたま別の配列を引き当ててペーパーにつながった経験がありますが。。。) >RevaTraAceを使っています。 TOYOBOのですか？私も使っていますが、gDNA Removerはお使いですか？そうであれば、かなりの高確率でgDNAは消えますが、以前、試したところ、カラムで精製しただけの(この時点で、DNase処理はしていますが。)RNAを多めに入れると、リアルタイムでgDNAが検出されます。(Ct値からすると、おそらくゲル泳動でも見えるレベルだったかと。。。) >real-time PCRを行う以前の様々な確認及び適正条件の把握が目的です。 行われていることは、リアルタイムの条件検討として、不適切かと思います。サンプル条件の確認は、バイオアナライザ等でRINという値を見れば良いかと思います。また、PCR条件の確認は、SYBR法を使うのかTaqMan法を使うのかでもかわってきます。そもそも使う試薬が違うわけで。。。 また、今回のPCRで使われているプライマーは、リアルタイム用でしょうか？ リアルタイムの前に確認しとかないといけないのは、プライマーダイマーがどのくらいできるのか？ということではないかと思いますが、いかがでしょうか？(SYBR法を使われるととくに大きな問題になります) >流石に通常のPCRもままならない状態でreal-time PCRを行うのは難しいのではないかと思うのですが、如何でしょう？ ここ数ヶ月でやる必要が出てきて未だに悩みに悩んでいる段階ですのでreal-time PCRは通常のPCR操作である程度のことが出来ないと無理だと念を押されているのですが… PCR操作というよりも、ピペット操作に慣れ、適切に行える必要は最低限あるかと思います。あとは、リアルタイムの原理についてきちんと知識を持っていたら問題なく出来るかと思います。 (まあ、ラボの方針ですから、口出しできませんが、ラボ入りたて1週間の学生に(ピペット操作は可能。事前にリアルタイムについて勉強はさせましたが。。)、リアルタイムをやらせたことがありますが、なんなくこなしました。まあ、そんなレベルです。) 論文に書いている条件でやれば、普通うまくいく事が多いですけどねえ。。。 私は、gDNAが消えていないに1票。

(無題) 削除/引用 No.1062-20 - 2012/10/29 (月) 12:35:47 - Troubled+Chemie > いまいち、内容をきちんと把握しきれていませんが、プライマーはintron spancingの設計になっているのですか？ 以前にも書きましたが、使えるプライマーを文献から引っ張ってきたのみですので、そのあたりは不明です。 > 逆転写酵素は何を使われているのでしょうか？ RevaTraAceを使っています。 > また、実験目的は何でしょうか？ real-time PCRを行う以前の様々な確認及び適正条件の把握が目的です。 > あと差をきちんと出したいのであれば、リアルタイムPCRすればよいのではないでしょうか？ 流石に通常のPCRもままならない状態でreal-time PCRを行うのは難しいのではないかと思うのですが、如何でしょう？ ここ数ヶ月でやる必要が出てきて未だに悩みに悩んでいる段階ですのでreal-time PCRは通常のPCR操作である程度のことが出来ないと無理だと念を押されているのですが…

(無題) 削除/引用 No.1062-19 - 2012/10/29 (月) 05:10:06 - おお >[Re:10] Troubled+Chemieさんは書きました : > > ・cDNAサンプルにおいてgDNAのコンタミはありますか？ > gDNAのコンタミに関してはカラムを通しているためないと考えております。 最近のきっとはリアルタイムPCRなどを意識してgDNAがPCRに影響ないほど取り除けるようなくふうがされていますが、通常の(昔からある)キットのからむはgDNAが除けるといううたい文句はありますが、PCRレベルでは無視できないほどの量がコンタミしています。恐らくはこの辺は検討済みで、適切な者をおつかいとはおもいますが、ねんのため。

(無題) 削除/引用 No.1062-18 - 2012/10/29 (月) 00:10:51 - おお >[Re:17] KENさんは書きました : > あと差をきちんと出したいのであれば、リアルタイムPCRすればよいのではないでしょうか？ > PCR→ゲル泳動で2サイクル程度のバンドの濃度差を見るというのは、いささか定量的ではないと思います。 そうですよね。私もそこを最初に心配したのですが。。。

(無題) 削除/引用 No.1062-17 - 2012/10/28 (日) 20:52:33 - KEN >>gDNAのコンタミに関してはカラムを通しているためないと考えております。 いまいち、内容をきちんと把握しきれていませんが、プライマーはintron spancingの設計になっているのですか？ intron spancigであればよいかと思いますが、DNaseは経験的に効きが弱いこともあり、案外genogmicが増えてたりすることがあります。リアルタイム用の試薬を使うと、そういうことがなくなりましたが、以前使っていた某大手メーカーの試薬では、かなり頭を悩まされたことがあります。 逆転写酵素は何を使われているのでしょうか？ また、実験目的は何でしょうか？ 一つの手としては、1step RTでやってみるとかはいかがでしょう。 あと差をきちんと出したいのであれば、リアルタイムPCRすればよいのではないでしょうか？ PCR→ゲル泳動で2サイクル程度のバンドの濃度差を見るというのは、いささか定量的ではないと思います。

なるほど… 削除/引用 No.1062-16 - 2012/10/27 (土) 20:30:15 - Troubled Chemie > 0.25と1で差が見られないなら感覚的に増幅が飽和しているのではと、、、すでに指摘にありますように、サイクル数を徐々に下げた方がいいでしょう。 > 前述の通り、27サイクルと29サイクルで明日行ってみようと思います。 > たとえば理想的な増幅効率は1サイクルに2倍で、2倍の濃度差は1サイクルで追いついてしまいます。それでさらに飽和してくるとさは見れないともいえるわけで、増殖効率をさげると(アニーリンク温度を高めにせってして、時間を短めにするとか)2倍のさは1サイクルで追いつかなくなります。 アニーリング温度に関してはforward&reverse primerのTmの平均-5℃に設定しているので結合しやすかったのかもしれません。 そもそも自分で設計したものではなく、似たような研究で同じ種のマウスを用いて行っている文献から引っ張ってきたものなので、そのあたりは落ち度があったかもしれません。そもそものアニーリング温度は55〜60程度がいいとされていますが、今回のプライマーのTmアベレージがそもそも49程度ですので更に下げていると非常に結合しやすかったのも原因かと思います。 ですので、27サイクルとの比較（これは単に増えるかどうか）と29サイクルが49=Tm Averageの温度でアニーリングさせる事により、差が出てくるのかという事について明日挑戦してみたいと思います。

全34件 ( 1 〜 20 )　 前 | 次 　1/ 1. 2. /2

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---