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(無題) 削除/引用 No.10617-3 - 2022/07/13 (水) 05:38:16 - チェリーボーイ >みさん ありがとうございます。外来遺伝子の発現はWBで確認しています。mCherryはWB未実施なのでやってみようかと思います（光っていないのでたぶん出ないと思ってました）。 RNA抽出は一般的なキットを用いたカラム精製で行っており、DNAの分解にはオンカラムのDNase kit（PureLink DNase I）を使用しています。ただ、フロースルーサンプルの電気泳動でゲノムDNAのコンタミを除去できているかはqPCR用サンプルのルーティンではこれまで確認してきませんでした。 セロタイプは同一細胞株に対して少ないながらも実施例がありました。

(無題) 削除/引用 No.10617-2 - 2022/07/12 (火) 11:09:38 - み >[Re:1] チェリーボーイさんは書きました : > 細胞からのRNA抽出をAAV入りの培地除去後にPBSで細胞洗浄せずに実施したのがまずかったかとも思いましたが、AAVゲノムはDNAなのでこれは関係ないかなと考えています。 > RNA調製の詳細が記載されていないので分かりませんが、ゲノDNAを積極的に除去する処理をしていないならRT-PCRのtemplateになり得ませんか？ ヒト細胞には感染しているということなのでウイルス自体は大丈夫そうですが、マウス細胞（種の違いというより細胞種が問題）に親和性がある血清型ですか？外来遺伝子の蛋白発現は確認できますか？

ヒト細胞で発現するmCherryがマウス細胞で光らない 削除/引用 No.10617-1 - 2022/07/12 (火) 08:46:32 - チェリーボーイ こんにちは。AAVを使ってヒト細胞に外来遺伝子をトランスダクションしたときにmCherryが強い蛍光を示すコンストラクトを作ったのですが、マウス細胞にin vitroで導入したところmCherryが全く光らないという問題を抱えたため、相談させてください。 使用しているpAAVのコンストラクトは標的遺伝子をCMVの下流で発現し、2Aペプチドを挟んでmCherryを発現するようになっています。マウス細胞にこのAAVをかけたとき、可能な限りMOIをあげても顕微鏡下で全くmCherryシグナルを拾えなかったのでまだMOIが足りないのかなと考えました。しかし、試しに細胞からRNAを抽出してqPCRをかけてみると、標的遺伝子もmCherry mRNAも無処置の細胞に比べて10000倍以上発現しており、mRNAレベルでは発現が誘導できているようでした。 AAVを細胞にかける⇒mCherry mRNAは誘導されている⇒光らない ということで、翻訳がうまくいっていないのかなと考えたのですが、転写レベルではマウス細胞でも発現が誘導されていると思われるmCherryがタンパクレベルでは機能していない（光らない）理由をどのように考察したらよいか、そしてどのような解決法がありうるでしょうか。 例えば mCherry のコドン最適化が効く、などありえるでしょうか、よく使われる蛍光タンパク質なので考えにくいかなとも思っています。 細胞からのRNA抽出をAAV入りの培地除去後にPBSで細胞洗浄せずに実施したのがまずかったかとも思いましたが、AAVゲノムはDNAなのでこれは関係ないかなと考えています。 よろしくおねがいします。

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