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(無題) 削除/引用 No.10616-10 - 2022/07/22 (金) 02:32:58 - おお >[Re:9] SYBR masterさんは書きました : > > Ribogreenは2本鎖と1本鎖は,たぶんex(650 nm)とem(700 nm)で区別していると思います。ただ1本鎖の波長データは見つけられたのですが、dsDNAに対する波長データは見たことが無いですが、dsDNAを混ぜたデータで、DNAに影響を受けないデータはInvitrogenが出していました。 ありがとうございました。Invitrogeneがデーターを示してたのですね。ちゃんと見れてませんでした。 私は以下の文献のFig１をみてました。 doi.org/10.1093/plankt/24.5.511 calf thymus DNAをつかってRiboGreenの蛍光を測っているようですが、RNAより強い蛍光がでています。BioTek, microplate reader, filters: 485/30 for excitation and 528/20 for emission と書いているので波長を区別してはなさそうです。何でしょう、どれくらい信用できるのかと言われるとわからないですが、、、 > SYBR GreenIIはRNAのex(497 nm)でem(521 nm)ですが、ゲル写真撮るとほぼ同じに見えるので、dsDNAのexもem値が近いため区別できない、と記憶しています。 了解です。

(無題) 削除/引用 No.10616-9 - 2022/07/21 (木) 19:37:42 - SYBR master >[Re:8] おおさんは書きました : > RiboGreenもDNAに反応しますよね。RTように調製したものならDNAはかなり抑えられていると思いますが、それでも影響が大きいですか？in vitro transcriptionもテンプレートはDNAだし、精製という点では細胞からRNAを取るのとDNAが入っている状況は大雑把には変わりないと思いますけど。 Ribogreenは2本鎖と1本鎖は,たぶんex(650 nm)とem(700 nm)で区別していると思います。ただ1本鎖の波長データは見つけられたのですが、dsDNAに対する波長データは見たことが無いですが、dsDNAを混ぜたデータで、DNAに影響を受けないデータはInvitrogenが出していました。ただ、ssDNAとRNAを混ぜて測ったことは無いので、そこが区別できるかは判りません。2本鎖と1本鎖でexとemの値が変わる色素としては、アクリジンオレンジが有名です。 SYBR GreenIIはRNAのex(497 nm)でem(521 nm)ですが、ゲル写真撮るとほぼ同じに見えるので、dsDNAのexもem値が近いため区別できない、と記憶しています。

(無題) 削除/引用 No.10616-8 - 2022/07/20 (水) 01:05:36 - おお >[Re:7] SYBR masterさんは書きました : > >[Re:4] おおさんは書きました : > > 私の方ではSybr green IIというのを見つけまして、 > > SYBR Green IIはssDNAに検出に、日常的に良く使用しています。 > > ただSYBR Green IIは核酸なら何でも光る（Emission値 は違うけど、結構被っている）ので、細胞や組織から抽出RNAの定量には向いていないと思いますよ。 in vitro transcription したRNAで、精製した後なら大丈夫だと思うけど。 RiboGreenもDNAに反応しますよね。RTように調製したものならDNAはかなり抑えられていると思いますが、それでも影響が大きいですか？in vitro transcriptionもテンプレートはDNAだし、精製という点では細胞からRNAを取るのとDNAが入っている状況は大雑把には変わりないと思いますけど。 わたしの場合はTotal RNAではなく更に手を施しているので、DNAが検出できようとあまり気にしてはないのですけど。

(無題) 削除/引用 No.10616-7 - 2022/07/19 (火) 22:17:02 - SYBR master >[Re:4] おおさんは書きました : > 私の方ではSybr green IIというのを見つけまして、 SYBR Green IIはssDNAに検出に、日常的に良く使用しています。 ただSYBR Green IIは核酸なら何でも光る（Emission値 は違うけど、結構被っている）ので、細胞や組織から抽出RNAの定量には向いていないと思いますよ。 in vitro transcription したRNAで、精製した後なら大丈夫だと思うけど。 PicogreennやRibogreenを使用したと思う濃度測定キットは今良く使用しています。夾雑の非対象核酸を無視できるときがあるので、偶にnanodropで測定したデータとの照合に、他の研究室から要請があって、測定することがあります。

(無題) 削除/引用 No.10616-6 - 2022/07/19 (火) 13:42:56 - おお >[Re:5] G25さんは書きました : > ちなみに、 > 蛍光法による核酸定量をプレードリーダーで行うアプリケーションを製造元が紹介していたり、 > あるいは逆に、核酸蛍光試薬の使用法の選択肢としてプレードリーダーが上げられていたりもします。 DNAをHoechstなどを使って定量するというのも昔から見られますね。リンクありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.10616-5 - 2022/07/19 (火) 13:33:15 - G25 ちなみに、 蛍光法による核酸定量をプレードリーダーで行うアプリケーションを製造元が紹介していたり、 https://www.tecan.com/doc?t77=TN_Inf200_Quant%20iT%20PicoGreen_Infinifte%20F_M%20200_395180_V1.0.pdf&cid=6286341916 あるいは逆に、核酸蛍光試薬の使用法の選択肢としてプレードリーダーが上げられていたりもします。 https://www.thermofisher.com/jp/ja/home/life-science/cell-analysis/fluorescence-microplate-assays/microplate-assays-nucleic-acids.html なのでプレートリーダーによる測定はまったく違和感のあることではないです。 蛍光が測れるプレードリーダーがあれば、それ専用の機器を買わなくていいし（これ結構でかい）、なんなら多サンプル測定なんかでメリットすらある。

(無題) 削除/引用 No.10616-4 - 2022/07/19 (火) 02:22:11 - おお >[Re:2] zamさんは書きました : ありがとうございました。私の方ではSybr green IIというのを見つけまして、ゲル染色などがメインですが文献的にはプレートリーダーなどではかっているものもあるようで候補かもしれないなぁと思っていましたが、お示しの試薬には行き着かず情報を共有していただいて大変ありがたく思っています。 値段、特性などいろいろと見ていってどうするか決めたいと思います。 >[Re:3] LPSさんは書きました : > あえて蛍光でプレートリーダーを使って測定されようとしている理由を教えていただけませんか。 端的に言うと収量とラボの環境ということです。

(無題) 削除/引用 No.10616-3 - 2022/07/18 (月) 21:42:12 - LPS おおさんは、この分野での経験がとても長いようにお見受けするのですが、あえて蛍光でプレートリーダーを使って測定されようとしている理由を教えていただけませんか。

(無題) 削除/引用 No.10616-2 - 2022/07/18 (月) 14:24:42 - zam 1. Thermoを見たら、Ribogreenはとりあえずキット（RiboGreen、バッファー、RNAスタンダード）で売っていますね。 1mL、113,000円。 Ex 480nm、Em 520nm ttps://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R11491?SID=srch-srp-R11491 2. PromegaのQuantifluorはRibogreen同等品のようです。たぶん。 1mL、59,000円。 Ex 492nm、Em 540nm ttps://www.promega.jp/products/rna-analysis/dna-and-rna-quantitation/quantifluor-rna-system/?catNum=E3310 3. AAT BioquestのStrand BriteはCosmo経由で1mLで69,000円です。 Ex 509nm、Em 529nm （プレートリーダーの設定にはEx 490nm、Em 525nmと書いてますが） ttps://www.cosmobio.co.jp/product/detail/strandbrite-green-rna-quantifying-reagent-abd.asp?entry_id=17502 ttps://www.aatbio.com/products/strandbrite-green-rna-quantifying-reagent-200x-dmso-solution?unit=17610 既知でしたらご容赦ください。 私はいずれも使ったことがないので使用感はわかりません。悪しからず。

RNA 定量 削除/引用 No.10616-1 - 2022/07/12 (火) 02:29:30 - おお RNA 定量を蛍光を使ってプレートリーダーとかで測りたいと思っています。 Ribogreenは色素として候補なのですが、色素だけ単独で購入できますか？あるいは他の単独で色素だけ購入できるRNA定量に使える蛍光色素をご存知であれば教えていただきたいと思います。

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