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(無題) 削除/引用 No.10609-7 - 2022/07/10 (日) 12:41:05 - おお >５０pgが切れ残りです。コンピテントは１マイクログラムあたり１０の八乗コロニーをつくるぐらいはあるだろうから、これでバックグランドは１００個。 計算間違えでした。１００個でなく５０００個ですね。

(無題) 削除/引用 No.10609-6 - 2022/07/10 (日) 12:24:16 - taka 皆様ご返信ありがとうございます。 すいさん すみません、教えていただきたいのですが、 私が使用しているのは、日本ジェネティクスのFastGeneです。 すいさんのおっしゃる意味というのは、 日本ジェネティクスの場合、カラム精製の効率が良くないため、切れ残りを想定して切り出しから行った方がよい。 キアゲンの場合は、カラム精製の効率がいいため、多少切れ残りがあっても大きな支障はない。 という意味でしょうか？ 自分の表現が伝わりづらかったらすみません。

(無題) 削除/引用 No.10609-5 - 2022/07/09 (土) 02:04:34 - おお >カラム精製だけの場合、制限酵素の切れ残りが少し気になりますが、In-Fusionでのクローニングで特に問題なければ、カラム精製を行おうと考えています。 制限酵素にもよるかもしれませんがまあ大丈夫っぽくも思うし、通常のライゲーションじゃまになるほどバックが上がるというのはあまりなかったです（ただわたしはバックグランドを最初にチェックしてそれに合わせてDNA量をきめていた）。ただし、 ＞(制限酵素の切れ残りは、ごくごくわずかという想定です) こういうのって具体的想定は難しいかもしれませんけど、たとえば９９.９％が少なくともどちらかの酵素で切れていたとして、切れ残りは千分の一。In-Fusionはプラスミドは５０ngぐらい使うんですか？なら５０pgが切れ残りです。コンピテントは１マイクログラムあたり１０の八乗コロニーをつくるぐらいはあるだろうから、これでバックグランドは１００個。In-Fusionでできるコロニー数は意外と少ないようですから、通常５０個として三ぶんの１があたりという計算。コンストラクトの相性がIn-Fusionとわるければ１０個ぐらいポジのコロニーができたとして１０個に一つがあたり。まあ２４個ミニプレップしたら拾えなく伴ないけど１クローン拾えたとしてPCRのエラーが入っていたら使えない。コロニーPCRがワークするならもう少し効率よく拾えるのでなんとかなる。 実際はダブルDigestionだしもっと低そうですが、こう計算するとちょっと怖い。探せばそれぞれの制限酵素処理でIntactのプラスミドのTransformation能がどれくらい落ちるのかとかデーターがあるかもしれないが、どれくらい切れ残りがあるかは想像もつかないわけで、余裕があるなら切ったプラスミドをそのままトランス・フォーメーションしてバックを確認してゲル精製するか決めるというのもやり方かも知れません。 ゲル抽出キットについてはこちらのNo.10532-13も参考になるかもしれません。 http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2012/biotechforum.cgi?mode=view;start=6;Code=10532

(無題) 削除/引用 No.10609-4 - 2022/07/08 (金) 23:23:45 - すい 私の感覚では、infusionに用いるDNAは、精製度が高い方が成功する印象です。 そのためには日本ジェネティクスの精製キットでは、ゲルからの切り出しを行った方が良いです。 またキアゲンのキットを用いる場合は、カラム精製の実でも大丈夫な印象です。

(無題) 削除/引用 No.10609-3 - 2022/07/08 (金) 22:20:17 - taka テロはいけないさん ありがとうございます！ 切り出し精製せずにカラム精製で行おうと思います。 PS.テロは絶対にダメです。阿部さんご冥福をお祈りいたします。。

(無題) 削除/引用 No.10609-2 - 2022/07/08 (金) 13:20:51 - テロはいけない no cutの切れ残りが無視できるなら切り出すことによる改善は原理上はありません。また、現実に私も切り出さないで上手くいってます。

クローニングの際のプラスミドの切り出し精製 削除/引用 No.10609-1 - 2022/07/08 (金) 13:14:59 - taka ベクターのクローニングについてもしよければ教えてください。 ベクターのマルチクローニングサイトを、二種類の制限酵素で消化して、インサートをIn-Fusionにより組み込もうと考えています。 インサートの方は、2000bpほどで、PCR後にカラム精製を行う予定ですが、プラスミドの方は、制限酵素消化後、切り出し精製を行った方がよいでしょうか？ それともカラム精製だけでも問題ないでしょうか？ カラム精製だけの場合、制限酵素の切れ残りが少し気になりますが、In-Fusionでのクローニングで特に問題なければ、カラム精製を行おうと考えています。 (制限酵素の切れ残りは、ごくごくわずかという想定です) もしご存じの方いれば、アドバイスいただければありがたいです。 よろしくお願いします。

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