>[Re:1] 研究者のたまごさんは書きました :
> こんにちは
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> コントロールはGFP発現しているのですが、対象の方はGFP発現が低下し、また、間質などGFPが発現しないだろう組織にも非特異的に反応しています。
>
> この発現パターンが遺伝子改変によっていおこっているのか、Preparationでおこっているのかわかりません。Preparationら、見直したほうがいいかと考えているのですか、ご意見あれば教えていただけないでしょうか？
いろいろ混乱しているようですが、まあ経験がないことに対してはそういうことがあっても不思議ではないと思います。まずタイトルの「固定でGFPの発現が低下するか」という書き方もそういうのを表しているような気がします。GFP自身は減らないでしょう。むしろ前述のように固定で蛍光活性が失われるというのが本質だと思ってます（GFPの蛍光を見ているのならば）。
しかしながら、「間質などGFPが発現しないだろう組織にも非特異的に反応しています」というふうに書かれますとあたかも免疫染色で抗体が反応してその結果蛍光や発色が見られないような表現にもおもえます。なのでサイド確認です。GFPの蛍光を検出しているのですよね？
組織を固定して何らかの蛍光を見る場合にはネガコンで自家蛍光をチェックするのがベストだと思います。そうすることにより検出しているシグナルがバックグランドなどのシグナルを拾っているだけなのか判断できます。またコントロールで発現を確認しているようですが（どんなコントロールか察しが付きませんが）、あなたのサンプルでシグナルが弱いなら、そのシグナルを出すためにソフトがコントラスト、ブライトネス、露光時間などをオートで決めている可能性がありますが実際どうなんでしょうか。この弊害は従来バックグランド程度のシグナルであってもそれに合わせてパラメーターを設置してしまうので、従来ないものまで見てしまうということです。またイメージ間の比較が難しくなり、例えばネガティブコントロールと条件が違うとバックグランドや自家蛍光なのか、シグナルなのか検討がつかなくなります。
それはそうと、GFPの従来の蛍光が固定により弱くなるのでGFP抗体で免疫染色するというのはよくある話です。また、発現量に関してはWBなどでチェックする必要も出てくるかもしれません。 |
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