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マウス脳へのiontophoresisによるAAV injectionがうまくいかない トピック削除
No.10591-TOPIC - 2022/06/30 (木) 16:21:18 - rek
iontophoresisで、マウスの脳表面に蛍光タンパク質を発現するAAVを注入したいのですが、数週間後にサンプリングしても、ほとんど発現していないです。タイターも十分で、AAVが使えることは確認済みです。

使ってる機械は、MIDGARD PRECISION CURRENT SOURCEで、キャピラリーに3uLほど液を入れて、銀線に赤いコード、尻尾に黒いコードをつなぎ、3.0uA, 7s ON/OFFのpositive current pulseを与えています。

そもそも脳に液が入ったのかを疑い、色素(Dextran, Alexa Fluor™ 488; 3,000 MW, Anionic)を混ぜてInjection時に観察したところ、電気を流す前に、脳脊髄液がキャピラリーに逆流しているように見えました。
結構な時間、電流を流しても、色素が下にいってくれないです。

周囲でやっている人がおらず、古い機械を引っ張り出してきたので、故障も疑っているのですが(計測すると、ちゃんと電流は流れていました)、そもそも実験条件に問題などないでしょうか。

何か、間違っているポイントや解決する方法などがあったら教えてください。
 
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(無題) 削除/引用
No.10591-5 - 2022/07/01 (金) 20:43:18 - AA
失礼しました。色素自体のiontophoresisを想定してしまっていました。
ただ、お示しの色素も"Anionic"とありますが大丈夫でしょうか?

(無題) 削除/引用
No.10591-4 - 2022/07/01 (金) 16:16:41 - rek
AAさん
Alexa Dyeではなく、Dextranなどくっついてる分子の電荷によって決まると思っているのですが、違いますか?
ありがとうございます。キャピラリーは細くしてみようと思います。

(無題) 削除/引用
No.10591-3 - 2022/06/30 (木) 17:50:44 - AA
>>電気を流す前に、脳脊髄液がキャピラリーに逆流
こちらについてはおそらくキャピラリーの先端を大きく割すぎで、毛細管現象で逆流していると思います。もっと細い先端にすると解決すると思います。

(無題) 削除/引用
No.10591-2 - 2022/06/30 (木) 17:49:27 - AA
うろ覚えで恐縮ですがAlexa dyeはnegative chargedじゃなかったでしょうか。
>>銀線に赤いコード、尻尾に黒いコード
となると向きが逆なのではという気がします。

マウス脳へのiontophoresisによるAAV injectionがうまくいかない 削除/引用
No.10591-1 - 2022/06/30 (木) 16:21:18 - rek
iontophoresisで、マウスの脳表面に蛍光タンパク質を発現するAAVを注入したいのですが、数週間後にサンプリングしても、ほとんど発現していないです。タイターも十分で、AAVが使えることは確認済みです。

使ってる機械は、MIDGARD PRECISION CURRENT SOURCEで、キャピラリーに3uLほど液を入れて、銀線に赤いコード、尻尾に黒いコードをつなぎ、3.0uA, 7s ON/OFFのpositive current pulseを与えています。

そもそも脳に液が入ったのかを疑い、色素(Dextran, Alexa Fluor™ 488; 3,000 MW, Anionic)を混ぜてInjection時に観察したところ、電気を流す前に、脳脊髄液がキャピラリーに逆流しているように見えました。
結構な時間、電流を流しても、色素が下にいってくれないです。

周囲でやっている人がおらず、古い機械を引っ張り出してきたので、故障も疑っているのですが(計測すると、ちゃんと電流は流れていました)、そもそも実験条件に問題などないでしょうか。

何か、間違っているポイントや解決する方法などがあったら教えてください。

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