全8件 ( 1 〜 8 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.10589-8 - 2022/07/02 (土) 07:24:21 - zam 質問者様に限らず、ゲル抽出後の泳動チェックで複数のバンドが見られるという質問が投げかけられることが度々あります。 原因として最も考えやすいのは、コンタミネーションです。汚染源としてはゲル抽出キットの汚染、特にゲル溶解バッファーか溶出バッファーの汚染が怪しいです。あるいは泳動槽、泳動バッファー、ピペット、チップ、カミソリ、トランスイルミネーター、人間、実験環境、その他が汚染源として考えられます。 PCRをよく使用する部屋、実験台、ピペットはDNAでかなり汚染されていると考えたほうがよろしいと思います。 対処としては汚染源の排除です。バッファー類の新調、実験器具等や実験台等については次亜塩素酸ナトリウムで除染する、フィルター付きチップを使う、人間についてはできる限り防護するということかと思います。 もう一つ考えられることは、ゲル抽出過程によるDNAの変性もしくは異常なアニールです。こちらはゲル抽出後のDNA溶液を加熱・冷却により解消したという報告がネット上のどこかにございました。 なお全般的な対処方法としては、質問者様の状況がわかりませんので思いつくまま記しますが、まずはゲル抽出キットをやめること。そしてローメルティングアガロースの使用、電気溶出、あるいはゲル濾過、フェノール抽出・エタノール沈殿、PCRクリーンアップキット、HPLCなどがよいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.10589-7 - 2022/07/01 (金) 15:04:35 - G25 >PCR産物は1本バンドで、そのバンドをゲル抽出しているのですが、 ということだから、あとから見られた複数のバンドはその一本のバンドのDNAから派生したものというのは確か。当初の段階で見えないほど微量の副産物が仮にあったとしても、目的のDNAの精製の過程で副産物の比率はむしろ下がるはずなのに、逆に濃縮されて見えるようになったとは考えにくい。

(無題) 削除/引用 No.10589-6 - 2022/06/30 (木) 18:42:17 - momo 目的のバンドのサイズと新たに現れるバンドの見かけ上のサイズを書いた方が考えられる原因が絞れると思います。

(無題) 削除/引用 No.10589-5 - 2022/06/30 (木) 13:29:48 - asan DNAのアガロール電気泳動もタンパクのSDS-PAGEも大量に投入すれば多少引きずってサイズ外のところを切り出しても持ち込むことはあります。上手くやればかなり綺麗に分かれますが、0:100ではないです。ゲル切り出しの精製で量的キャパがあるのはそれも理由です。 実際、LC/MSのサンプルの前処理でゲル切り出しをしても、検出感度が高いのでわずかなテーリングなどを引きずってか変な位置で出てくる場合はあります。強い共有結合等によってSDS-pageでも生じる明らかなバンドほど決まったサイズで同定されるわけではないので、おそらくゲルでの泳動時に引きずったようなアーティフィシャルなサイズ持ち込みでしょう。

(無題) 削除/引用 No.10589-4 - 2022/06/30 (木) 11:18:22 - seventh 非特異産物が混じっていて実験に問題があるのですか？ 泳動時のアーティファクトとかではなく非特異産物の混入だとしても、クローニングなどの実験では影響は大きくないと思いますが。 その現象に対する対策と実験を成功させる対策は別のものかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.10589-3 - 2022/06/30 (木) 09:46:08 - G25 ・泳動サンプルのバッファーが不十分 この可能性はかなりあるんじゃないかと思っています。 泳動サンプルはどのように調製しているでしょうか。 普通、ローディングバッファは実際はバッファ成分を含んでいないので、十分にバッファされたDNA溶液に加えないとDNAのチャージがおかしくなります（酸性に偏ってチャージが減弱したり）。 DNA溶出液は低イオン強度の薄いバッファあるいは純水などのはずですから、これにいきなり、あるいは水でボリュームを合わせた状態でローディングバッファをいれると、移動度がおかしくなってあなたの言われるような状態になることがあります。泳動サンプルの調製はTEや酵素反応バッファなどで十分にバッファされた状態を保って行いましょう。 ・精製DNA断片の部分的あるいは完全な変性（解離） シリカカラム系では、処理中に水素結合が弱まり一本鎖に解離することがあります（キアゲンのマニュアルには記載があります）。これは鎖長が短い場合で、泳動像は本来のバンドより低分子側にぼやっと見えるものなので、今回のケースとは違いそうですが。

(無題) 削除/引用 No.10589-2 - 2022/06/30 (木) 09:00:39 - ぱん 補足ですが、ゲル抽出後に現れる非特異バンドは目的バンドのサイズよりも大きいです。

ゲル抽出後の非特異バンドについて 削除/引用 No.10589-1 - 2022/06/30 (木) 08:57:42 - ぱん PCR産物を泳動し、ゲル抽出キットを用いてDNAを精製しています。 PCR産物は1本バンドで、そのバンドをゲル抽出しているのですが、ゲル抽出後のDNAを泳動すると複数バンドがみられます。 目的バンドもあるのですが、その他の非特異バンドはどこからきていると考えられますでしょうか。対策等教えていただけますと幸いです。

全8件 ( 1 〜 8 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---