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(無題) 削除/引用 No.10579-8 - 2022/07/09 (土) 15:21:23 - おお ちょっとGROWTHが遅くないかな、、、ATCCによるとDoubling timeは２６時間、４日で１０倍以上になるはず。ラグ TIMEとか、ポピュレーション依存でいつも２６時間ではないにしても、５日目には１０倍以上になりそうだけど。細胞に問題があれば、新たに入手すべきかもしれません。 またATCCによると Complete medium: The base medium for this cell line is ATCC-formulated RPMI-1640 Medium, Catalog No. 30-2001. To make the complete growth medium, add the following components to the base medium: 2- mercaptoethanol to a final concentration of 0.05 mM; fetal bovine serum to a final concentration of 10%. ２MEを入れるとなっています。また、血清があってない（ロットに当たり外れがあることもたまにある）可能性もあるかもしれません。またATCCはATCC製のRPMIを推奨しているが 1 mM sodium pyruvateがはいっている。添加物なども確認してみるといいかもしれない。 加えてDo not allow the cell concentration to exceed 1 x 10^6 cells/mL. とも書かれている。 https://www.atcc.org/atcc/productsheetpdf/generatehtmlpdf/tib-202 薄めすぎると増えにくくなるという話もあるので、すでに私を含め指摘しているように、Conditioned mediaを使うこともしてみたらどうですか？

(無題) 削除/引用 No.10579-7 - 2022/07/09 (土) 14:05:45 - no 皆さま、ご回答ありがとうございます。 安定株を作製するため、まずは正常細胞で試験的に単一細胞からの増殖を検討していました。 アンホテリシンBを抜き培養して見ましたが、変化は見られませんでした。 継代培養(2×10^5cells/ml播種して1週間後2×10^6cells/mlまで増殖)では、問題なく使用できていたのですが単一細胞にすると増殖せず死んでしまいます。 この場合、細胞にどのような問題があるのでしょうか、、 回答頂けると幸いです。

(無題) 削除/引用 No.10579-6 - 2022/07/02 (土) 13:28:08 - おお 安定導入株という事なので導入した遺伝子がなんか影響してるんでしょうか。クローン拾うときにセレクションしてないとすると、すでにプールされたヘテロな導入済みの細胞があるという事なんでしょうか。いずれにせよ、導入したもので細胞が死にやすくなっているならrock inhibitorとか加えて細胞死を抑制するても有りかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.10579-5 - 2022/07/02 (土) 12:44:06 - bvんj THP-1細胞の培養上清（セミコンフレントくらいで２〜３日培養したもの）を培地に使ってみたらどうでしょうか。細胞由来の増殖因子とか生存に関わる因子が多く含まれていると思うので。

(無題) 削除/引用 No.10579-4 - 2022/07/02 (土) 08:08:33 - zam THP-1細胞は限界希釈しても普通に生えてきますので、質問者様の細胞に何らかの原因がおありかと思います。 私の経験上ですが、96穴（液体培地）で増殖できない細胞が寒天培地やメチルセルロース培地で増殖したことはありませんでした。（半）固体培地を試されるのはよいと思いますが、念のため申し上げます。 特段の理由がなければ、前の方がお書きになっておられるように、細胞を新調される方がよろしいかと思います。

Re: 浮遊細胞における単一細胞の培養 削除/引用 No.10579-3 - 2022/06/29 (水) 09:21:17 - 元気な細胞 昔、THP-1細胞を使って実験をしていました。 培養はそれほど問題はなかったように思います。THP-1細胞をクローニングしたいということは、現在使われている細胞に問題があるということでしょうか？それなら、新しく入手した方が良いと思います。 クローニング条件：Dish 　96well plate(平底,丸底)、培地　RPMI 1640 (FBS10%, ストレプトマイシン硫酸塩,ペニシリンGカリウム,アンホテリシンB） にアンホテリシンBを入れている理由は何でしょうか？これを入れないと培養状態が悪くなるのでしたら、何かの菌がコンタミしているのでしょう。 しかし、前の方が書いておられるように、アンホテリシンBは正常細胞にも影響を与えるので、緊急事態ならいざ知らず、維持している細胞にずっと入れるのは良くないと思います。 どうぞご参考になさってください。

(無題) 削除/引用 No.10579-2 - 2022/06/26 (日) 07:46:33 - おお ソフトアガーとかメチルセルロースでコロニー作らせたら？ あとすぐ思いつくのはConditioned mediaをつかうとか。 アンホテリシンBって必要ですか？結構細胞に悪さするイメージが。。。

浮遊細胞における単一細胞の培養 削除/引用 No.10579-1 - 2022/06/25 (土) 13:35:07 - no THP-1細胞において単一細胞からの増殖により、安定発現株を樹立しようとしています。 以下の条件で培養しているのですが、2週間経過しても増殖が見られず死んでしまいます。 Dish 　96well plate(平底,丸底) 培地　　RPMI 1640 (FBS10%, ストレプトマイシン硫酸塩,ペニシリンGカリウ　　　　　　 　　　　ム,アンホテリシンB） 30〜100μL インキュベーター　37℃ CO₂ 5% FBS濃度を20%に変更、増殖因子GM-CSFを導入、馴化培地なども検討してみましたがどの条件でも増殖しませんでした。 浮遊細胞におけるシングルセルクローニングにおいて、単一細胞からの増殖についてご存じの方に回答いただければ幸いです。 よろしくお願いします。

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