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(無題) 削除/引用 No.10571-9 - 2022/06/25 (土) 04:03:52 - vひ Cu,Zn-SODの阻害剤としてN-N′-diethyldithiocarbamate があるので、それ共存下で測定すれば分画なしにWhole cell lysateでもMn-SODの活性を測れる気がする。 もちろん化学物質てか薬だから特異性の問題は常に付いて回るし、濃度は検討して有効かつできるだけ低い濃度で使用したほうがいい。特に動物種が違えばSODの構造も少し違うだろうし至適阻害濃度や感受性も哺乳類と同じとは限らないのでそれも考えたほうがいい。 てか、書いてて今思ったんだが、そもそも軟体動物のSODを脊椎動物のSODの知識で語っていいのかどうかわからないんだが。HbとかもFeの代わりにCuくっつけてたりみたいに金属含有タンパク質とかうちらとは違うことあるでしょ。その動物種のSODやその他、対象とする酵素のことを勉強して、脊椎動物との異同は確認したほうがいいと思う。

(無題) 削除/引用 No.10571-8 - 2022/06/22 (水) 05:14:22 - おお >その論文(自分がやりたい研究も)では組織中に含まれるMn型、Zn型などを含む、すべての種類のSOD活性を測定していました。 それって方法論はどうなのよ。同じキット使ってたの？ あと一般的なはなしで膜を壊さなくていい場合もあって、プローブが膜を通過してくれる場合もありますね。

(無題) 削除/引用 No.10571-7 - 2022/06/21 (火) 23:50:44 - おお 研究のスタイルとか何を研究の中心に置くかで違ってくるかもしれませんが、ほんとに抗酸化酵素に関して仕事をしたいと思うのなら活性測定の方法論とか文献を読み漁ることをおすすめします。抗酸化酵素がメインの仕事でなくてもそういう論文を当たるとなんかきっとを買うのがバカバカしく（とまで言うと言いすぎかも）思うこともあります。場合によってはキットはうまく調製されていて（多分ニーズにあうようにとか）、ホームメードでやるよりうまくいくこともあるにはありますけどね。

(無題) 削除/引用 No.10571-6 - 2022/06/21 (火) 23:37:25 - ポンチャン 皆様　返信をありがとうございます、そして自分の説明不足があり、すみませんでした。 その論文(自分がやりたい研究も)では組織中に含まれるMn型、Zn型などを含む、すべての種類のSOD活性を測定していました。 種類によって局在している部分が異なることなどもあるのですね。 とりあえず、キットのメーカーにミトコンドリアを壊せるか問い合わせてみようかと思います。 色々な知識を頂けて大変勉強になりました。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.10571-5 - 2022/06/21 (火) 22:56:07 - bjm ホモジナイズに使用するbufferの組成がミトコンドリアを破壊するようなものであれば（界面活性剤などが添加されているなど）、ホモジナイズだけでミトコンドリアは壊れて中のタンパク質は上清に溶けてくるので、それ以上のことは必要ないのでしょう。kitのbufferはそうのような組成で作ってあるのだと思います。 もし抽出bufferがそういった組成でない場合はホモジナイズだけではミトコンドリアが十分壊れないので反復凍結融解でミトコンドリアを物理的に破壊する必要があるのでしょう。ただ凍結融解１回するだけでもミトコンドリアはかなり壊れますが。 なお、kitを使用するならば、実験目的から見て何か支障がない限りは、原則として少なくとも最初は全て説明書に準じて進めてください。 凍結融解による抽出はかなり昔はよく行われた方法のようですが、最近はあまり聞きません。凍結融解を反復することはタンパク質にはあまり良いことはなく、酵素活性の低下などのリスクも懸念されますのでできれば避けたほうが安心です。 GPXとSOD（例：Mn-SOD:ミトコンドリアマトリクス、Cu,Zn-SOD:細胞質およびミトコンドリア外膜、EC-SOD :細胞外）は細胞質とミトコンドリアに（さらにSODは細胞外にも）、カタラーゼは細胞質とペルオキシソームに分布しており、どれもコードする遺伝子、構造、機能や性質が異なりますが、これらはそれぞれ分けて測定しなくてもいいですか。それよっては抽出方法が異なってくると思うのですが。単に細胞内のトータルの活性の測定ということで良いということですか。

(無題) 削除/引用 No.10571-4 - 2022/06/21 (火) 21:12:18 - shii SODに関して言えば、Mn型やZn型などで局在している場所が異なるため、抽出液の画分が必要になる場合もあります。 まずはSODのどの型を対象にするかを決める必要があるかと思います。 ミトコンドリアならMn型です。 ミトコンドリア画分を取ってきた場合、きちんと取れているかの純度確認も必要になります。トータルのSOD を測定する際にMn型のみを阻害する阻害剤を用いたりする方法もあります。

(無題) 削除/引用 No.10571-3 - 2022/06/21 (火) 20:24:18 - おお キットの説明、その方法論を示した論文など見ないとわからないけど、膜を破壊するのにと凍結融解はまあまあ使われる。物によっては細胞内の酵素の測定で細胞膜を凍結で壊さないといけない場合も。他の方法としては膜を溶かすか断片化する方法でデタージェントが使われる。

(無題) 削除/引用 No.10571-2 - 2022/06/21 (火) 19:40:08 - qwert その論文とキットを提示しないと誰も確かなことは言えないと思うよ。 例えばSODにも種類があるわけで、細胞質にあるのもあればミトコンドリアに局在するのもある。 https://www.cosmobio.co.jp/product/detail/superoxide-dismutase.asp?entry_id=36215 マイルドで細胞質の分しか検出しないキットなら、ミトコンドリアを破砕する必要がある。 全部検出できるような設計ならわざわざ破砕する必要ない。 キットの説明を熟読して、分からなかったらメーカーに聞けば良い。 凍結融解で酵素が失活する可能性は当然にある(失活しない可能性もある)。 酵素量の測定なら、分解しなければ変性・失活してもまあ何とか。 酵素活性の測定なら失活しては困る。 参照した論文はどちら?

抗酸化酵素の測定について 削除/引用 No.10571-1 - 2022/06/21 (火) 19:03:15 - ポンチャン 現在大学院修士課程に在籍している学生です。調べても分からないため、本掲示板を利用されている有識者の皆様にご教授頂けますと嬉しいです。 今回、ある軟体動物の酵素(SOD,カタラーゼ,グルタチオン還元酵素など)を測定しようとしています。そこで、ある論文ではミトコンドリアの破壊のために、ホモジナイズ後の上清を3回凍結融解するというプロトコルが見つかりました。 しかし、測定キットのプロトコルのほうではミトコンドリアの破壊については触れられておらず、ホモジナイズ後の上清をそのまま使用するように書かれています。 そこでお聞きしたいのですが、 �@凍結融解のミトコンドリア破壊によって、酵素活性に何か変化は無いのでしょうか？ �Aもし細胞などの酵素活性を測定する際に、ミトコンドリアの破砕の工程が必要だとすると、なぜキットのプロトコルにはその工程が省略されているのでしょうか？ どうぞよろしくお願い致します。

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